劉利平，張悅，劉林森，郭躍華，張育森，鮑世韻

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院,廣東深圳 518000)

環(huán)境因素是腫瘤的發(fā)病原因之一。生物鐘是人體內(nèi)的生物節(jié)律，與自然界的日出、日落相同步，受多個(gè)生物鐘基因調(diào)控[1]。研究[2,3]發(fā)現(xiàn)，生物鐘紊亂的人群(如倒夜班)更易患乳腺癌、前列腺癌、膽管癌等惡性腫瘤。Per2基因是生物鐘基因家族中重要的成員之一[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)Per基因除了參與生物鐘調(diào)控外，還可抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸等多種腫瘤組織中呈低表達(dá)狀態(tài)，被認(rèn)為是潛在的抑癌基因。目前Per2在肝癌中的表達(dá)及意義國內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。CD133是肝癌干細(xì)胞的標(biāo)記物之一，在肝癌組織中高表達(dá)，與肝癌患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，CD133高表達(dá)的患者較易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[6]。Per2同CD133在肝癌組織中的相關(guān)性目前未見報(bào)道。本研究觀察了肝細(xì)胞肝癌組織Per2 的表達(dá)變化，并分析其與CD133的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011～2015年在深圳市人民醫(yī)院肝膽外科行肝癌根治性手術(shù)且經(jīng)病理證實(shí)的120例肝細(xì)胞肝癌患者，其中男97例、女23例，年齡32.6～70.2，平均53.4歲；乙肝表面抗原呈為陽性，HCV抗體陰性。所有患者術(shù)前均未接受過化療、放療、靶向治療及免疫治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷為原發(fā)性肝細(xì)胞癌；未見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；接受了肝癌根治術(shù)；手術(shù)切緣陰性，未見腫瘤細(xì)胞。排除標(biāo)準(zhǔn)：接受過放療、化療、免疫治療、靶向治療或中藥治療；乙肝表面抗原陰性；HCV抗體陽性；同時(shí)合并其他類型的惡性腫瘤；隨訪信息不全。術(shù)中保留120例患者癌組織、癌旁組織(距腫瘤距離均>2 cm)標(biāo)本。

1.2 肝細(xì)胞肝癌癌組織及癌旁正常組織Per2、CD133檢測 采用免疫組化染色法檢測癌組織及癌旁正常組織Per2、CD133，所有操作均嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。Per2、CD133蛋白在肝癌組織中均以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主，Per2根據(jù)細(xì)胞質(zhì)的染色程度及染色細(xì)胞的百分率來進(jìn)行評(píng)分[6]。Per2陽性細(xì)胞百分比<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分；細(xì)胞染色無色計(jì)0分，黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。兩者相乘即為最終分?jǐn)?shù)(代表蛋白相對(duì)表達(dá)量)，0～4分視為低表達(dá)，5～12分視為高表達(dá)。CD133根據(jù)陽性細(xì)胞比例和染色深淺評(píng)為 0～3分，0分：陽性細(xì)胞不超過1%；1分：陽性細(xì)胞超過1%，細(xì)胞呈黃色；2分：陽性細(xì)胞超過1%，細(xì)胞呈棕黃色；3分：陽性細(xì)胞超過1%，細(xì)胞呈棕褐色。其中0和1分定義為低表達(dá)，2和3分定義為高表達(dá)[7]。

2 結(jié)果

肝細(xì)胞肝癌癌組織及癌旁正常組織Per2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為5.05±0.30、7.18±0.31，二者比較，P<0.05。癌組織中Per2蛋白低表達(dá)58例(48.3%)、高表達(dá)62例(51.7%)。肝細(xì)胞肝癌癌組織及癌旁正常組織CD133蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.68±0.11、0.82±0.09，二者比較，P<0.05。癌組織中CD133蛋白低表達(dá)67例(55.8%)、高表達(dá)53例(44.2%)。

Per2蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。Per2蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、門靜脈侵犯有關(guān)(P均<0.05)。

表1 Per2蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者

Kaplan-Meier時(shí)間生存曲線分析結(jié)果顯示，癌組織中高表達(dá)Per2者、癌組織低表達(dá)Per2者總體生存率(OS)分別為(34.4±2.5)、(26.9±2.3)個(gè)月，二者比較，P<0.05；癌組織中高表達(dá)Per2者、癌組織低表達(dá)Per2者無瘤生存率(DFS)分別為(16.3±1.7)、(9.72±1.41)個(gè)月，二者比較，P<0.05。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，Per2與CD133在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.569,P<0.05)。

3 討論

生物鐘是人類在進(jìn)化過程中與自然界同步而形成的內(nèi)在生物節(jié)律，在體溫、呼吸、血壓、進(jìn)食、睡眠、血糖、內(nèi)分泌等諸多穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用[8]。生物鐘對(duì)人體精準(zhǔn)調(diào)控的分子機(jī)制在于生物鐘基因及其編碼蛋白構(gòu)成了自主調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄-翻譯反饋通路[9]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的生物鐘基因有CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cryptochrome 1 (Cry1)、Cryptochrome 2 (Cry2)、NPAS2、Casein Kinase 1 ε(CKIε)、timeless(Tim)、Rev-Erb和DEC等[10]，以上基因通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控形成的自反饋環(huán)來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的生物節(jié)律。生物鐘基因表達(dá)紊亂可導(dǎo)致生物節(jié)律異常，可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[11]。

period(PER)基因首先在果蠅的X染色體中發(fā)現(xiàn)，果蠅PER基因存在三種突變型，分別為perO、perL和perS，三種突變型的表型分別為晝夜節(jié)律消失、晝夜節(jié)律延長及晝夜節(jié)律縮短。隨后，小鼠和人的Per基因被發(fā)現(xiàn)，且存在Per1、Per2、Per3 這3種基因型[4]。后續(xù)研究[12]發(fā)現(xiàn)Per基因除參與生物鐘調(diào)控外，還能抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Per2基因在結(jié)直腸癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌、等多種腫瘤中呈低表達(dá)[4,8,9]。Su等[13]研究發(fā)現(xiàn)，沉默口腔鱗癌 SCC15細(xì)胞 中PER2的表達(dá)后，增殖相關(guān)基因Ki-67、 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MDM2、MMP2、癌基因c-Myc、抗凋亡蛋白Bcl-2、血管生成相關(guān)基因VEGF的表達(dá)均上調(diào)，抑癌相關(guān)基因 p53、凋亡相關(guān)基因 Bax、轉(zhuǎn)移抑制基因TIMP-2 的表達(dá)均下調(diào)；且Per2沉默后的SCC15細(xì)胞成瘤能力明顯增強(qiáng)。Per2沉默的肺腺癌細(xì)胞A549中(PI3K)/AKT/mTOR信號(hào)通路被激活，細(xì)胞對(duì)順鉑表現(xiàn)出一定的耐藥性。在A549/DDP耐藥細(xì)胞中上調(diào)Per2的表達(dá)可抑制(PI3K)/AKT/mTOR通路的活性和逆轉(zhuǎn)順鉑的耐藥性[14]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中的Per2 mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)量均低于低于癌旁組織，表明Per2低表達(dá)可能與肝癌的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)Per2在多發(fā)、腫瘤直徑>5 cm及伴血管侵犯的肝癌中陽性表達(dá)率更低，提示Per2低表達(dá)可能是肝癌預(yù)后不良的因素之一。生存分析顯示Per2低表達(dá)的肝癌患者無瘤生存率和總體生存率均明顯降低。提示Per2可以作為判斷肝癌患者術(shù)后預(yù)后的預(yù)測因子。肝癌是一個(gè)較易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，惡性程度非常高的腫瘤。肝癌術(shù)后檢測腫瘤組織中Per2的表達(dá)，對(duì)低表達(dá)的患者加強(qiáng)隨訪和監(jiān)測，有可能較早的發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的病灶，較早地給予處理可以改善患者的預(yù)后。

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的根源。腫瘤干細(xì)胞與普通腫瘤細(xì)胞的鑒別依賴于其表面的干細(xì)胞標(biāo)記物[15]。CD133是肝癌的干細(xì)胞標(biāo)記物之一，是一種5次跨膜糖蛋白，在1997年分別從人造血干細(xì)胞和CD34+的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中分離得到，并分別命名為AC133和prominin-1[16]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，人類的AC133和小鼠的prominin-1在細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的分布相似，基因具有高度相似性。人的prominin-1基因又稱為CD133[17]。CD133在正常肝組織中陰性表達(dá)，在部分慢性肝炎、肝硬化組織中陽性表達(dá)，可能與肝臟再生有關(guān)，這部分表達(dá)CD133的肝細(xì)胞可能是一種具有自我更新和定向分化能力的原始肝細(xì)胞[15]。CD133在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于其在癌旁、肝炎和肝硬化組織，顯示CD133陽性的肝癌細(xì)胞具有更高的細(xì)胞增殖能力和更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力。Chan等[19]研究發(fā)現(xiàn)，小肝癌和合并肝硬化的肝癌組織中CD133蛋白表達(dá)升高，CD133陽性的肝癌患者預(yù)后較差，CD133可作為判斷肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的有效標(biāo)記物。

綜上所述，肝細(xì)胞肝癌組織中Per2低表達(dá)、CD133高表達(dá)。Per2可作為判斷肝癌患者預(yù)后的標(biāo)記物之一。Per2和CD133在肝細(xì)胞肝癌中呈負(fù)相關(guān)，Per2可能對(duì)肝癌干細(xì)胞的增殖起抑制作用。