馬乳酒樣乳桿菌ZW3基因WANG_1108的特性及功能

王金菊，侯乾宇，楊 迎，耿偉濤，王艷萍*

乳酸菌是革蘭氏陽性細(xì)菌，其最終碳水化合物發(fā)酵主要產(chǎn)物為乳酸[1]，是一種公認(rèn)安全的益生菌。乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）是乳酸菌生長代謝過程中產(chǎn)生并分泌到胞外的一種天然高分子化合物，分子質(zhì)量大小通常在4.0×104～6.0×106u之間[2]，具體分為莢膜多糖和黏液多糖[3]。隨著人們對綠色、天然食品的不斷要求，乳酸菌EPS受到廣泛的關(guān)注。EPS不僅具有抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6-8]、免疫調(diào)節(jié)[9]等諸多生物活性，還可以作為天然的發(fā)酵劑、增稠劑、穩(wěn)定劑及乳化劑等[10-11]添加應(yīng)用到食品中。有報道[12-15]認(rèn)為乳酸菌之所以具有這些功能與細(xì)菌表面上的多糖成分有關(guān)。乳酸菌EPS本身具有許多生物活性[13-15]。文獻(xiàn)[16]報道了2 種常用的乳化劑羥甲基纖維素鈉和吐溫80能夠引起小鼠結(jié)腸炎和肥胖及代謝綜合癥，為乳化劑的不安全性提供了有力的證據(jù)，故依靠菌種自身的發(fā)酵特性實現(xiàn)產(chǎn)品的良好性能顯得尤為重要。但乳酸菌EPS合成產(chǎn)量普遍較低[17]，還不能滿足生產(chǎn)的需求，提高EPS產(chǎn)量成為急需解決的問題，因此需要對乳酸菌EPS合成相關(guān)的基因和合成途徑進(jìn)行研究[18-19]，提高EPS的產(chǎn)量，擴(kuò)大EPS在食品與非食品領(lǐng)域的應(yīng)用。

乳酸菌EPS合成分為4 個過程：單糖轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)、葡萄糖-1-磷酸的合成、糖的活化和連接聚合以及多糖的輸出[20-21]。其中，葡糖-6-磷酸與葡糖-1-磷酸的相互轉(zhuǎn)換、UDP-葡萄糖的生產(chǎn)量均涉及核糖核苷酸前體的供給，也是EPS生物合成途徑的重要控制點。由實驗室自行分離得到的馬乳酒樣乳桿菌ZW3（Lactobacillus kefiranofaciens ZW3）菌種具有良好的產(chǎn)糖特性，優(yōu)化的EPS產(chǎn)量達(dá)到2 000 mg/L以上，且目前已對ZW3全基因組進(jìn)行了測序[22]，為后續(xù)闡明其多糖產(chǎn)量與基因表達(dá)的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

本實驗以高產(chǎn)EPS的馬乳酒樣乳桿菌ZW3及產(chǎn)糖量降低的突變株2#為研究對象，通過對突變株基因組重測序以及與野生菌ZW3基因組比對分析出突變基因，并利用實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，RT-qPCR）技術(shù)分析可能與產(chǎn)糖相關(guān)的突變基因相對表達(dá)量，從中選出基因WANG_1108，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至表達(dá)菌株大腸桿菌（Escherichia coli）BL21中并分別測定其在野生菌與突變株中的酶活性，初步闡明突變基因與EPS產(chǎn)量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

馬乳酒樣乳桿菌ZW3、實驗室前期利用Mμ轉(zhuǎn)座技術(shù)獲得的產(chǎn)糖量下降的馬乳酒樣乳桿菌ZW3的突變株2#、表達(dá)菌株E. coli BL21（DE3）、質(zhì)粒pET28a（5 369 bp）均由本實驗室自行分離保存；重組質(zhì)粒pET28a-ZW3/2#-1108（7 652 bp）由本實驗室自行構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良MRS培養(yǎng)基：酵母粉45.0 g，葡萄糖20.0 g，乙酸鈉15.0 g，NaCl 0.15 g，半胱氨酸鹽酸鹽1.4 g，磷酸氫二鉀0.5 g，吐溫80 1 g，硫酸錳0.2 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.4，115 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需另加入2%瓊脂粉。

2YT培養(yǎng)基：稱取蛋白胨16 g，酵母浸粉10 g，NaCl 5 g，溶解后用蒸餾水定容到1 000 mL，NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基再加入2%瓊脂粉。

自誘導(dǎo)培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，丁二酸鈉5.4 g，二水檸檬酸鈉0.3 g，甘油25 mL，葡萄糖0.5 g，α-乳糖 2 g，Na2HPO42.55 g，KH2PO43.4 g，NH4Cl 2.68 g，Na2SO40.71 g，MgSO4·7H2O 0.493 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.03 g，蒸餾水定容至1 000 mL，115 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基需另加入2%瓊脂粉。

1.1.3 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶 立陶宛Fermentas公司；蛋白酶K（50 mg/mL）、Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、cDNA第一條鏈合成試劑盒 康為世紀(jì)生物科技有限公司；溶菌酶 生工生物工程（上海）股份有限公司；MμA轉(zhuǎn)座酶 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；6×Loading Buffer 天根生化科技（北京）有限公司；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinases，STPKs）酶聯(lián)免疫分析試劑盒 上海嵐派生物科技有限公司。

1.1.4 引物

引物均利用軟件Primer Premier 5設(shè)計，交由華大基因合成（表1）。

表1 本實驗使用的引物Table 1 Sequences of the primers used in this experiment

1.2 儀器與設(shè)備

HFsafe900型超凈工作臺 上海力申科學(xué)儀器有限公司；HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；DZKW-C型水浴鍋 河北黃華市航空儀器廠；普通藥物天平 上海精科天平廠；多功能厭氧培養(yǎng)箱 美國GeneScience公司；梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀、熒光定量PCR儀、Power PAC 3000電泳儀、SmartsoecTM3000型分光光度計、全自動凝膠成像儀美國Bio-Rad公司；YS100生物顯微鏡 日本Nikon公司；DYY-III-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌EPS產(chǎn)量的測定

以4%的接種量將野生菌ZW3和轉(zhuǎn)化子2#的種子液接種到新鮮改良MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧培養(yǎng)；每56、72、84、96 h取樣，將發(fā)酵液100 ℃水浴30 min，4 ℃、8 000 r/min離心15 min除去菌體；取一定體積的上清液裝入透析袋，4 ℃蒸餾水透析（截流量6 000～8 000 Da）直至測定透析的蒸餾水中無糖檢出。利用苯酚-硫酸法測定透析袋內(nèi)EPS含量，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品EPS產(chǎn)量。

1.3.2 野生菌株與突變株全基因組比對分析

利用第2代高通量測序技術(shù)對突變株2#進(jìn)行了全基因組重測序；利用Emboss軟件提取菌株基因序列，并將野生菌ZW3與突變株2#全基因組進(jìn)行比對，查找差異。利用在線軟件Clustalw分析比對堿基序列（http://www.genome.jp/tools/clustalw/）。運用生物軟件網(wǎng)的SMS在線翻譯工具對氨基酸進(jìn)行了翻譯（http://www.bio-soft.net/），并利用GenBank中的BLAST工具對氨基酸序列進(jìn)行比對（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。

1.3.3 突變基因的RT-qPCR分析

參考產(chǎn)糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Trizol法每24 h提取樣品RNA；利用HiFi-Script cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA；以cDNA為模板，利用表1所合成的各對引物驗證引物的特異性及擴(kuò)增效率，使用的染料為SYBR Green I。利用RT-qPCR對各基因的表達(dá)進(jìn)行測定。RT-qPCR總體系為20 μL，cDNA模板1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，2×qPCR SuperMix 10.0 μL，ddH2O 7 μL；RT-qPCR程序為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，退火30 s（各基因退火溫度參照表1），72 ℃延伸30 s，共進(jìn)行40 個循環(huán)。PCR程序之后立即執(zhí)行熔解曲線的測定：65～95 ℃，每隔0.5 ℃停留5 s檢測熒光強(qiáng)度。

1.3.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白表達(dá)

為驗證STPKs的活性與EPS產(chǎn)量的相關(guān)性，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-ZW3/2#-1108。以馬乳酒樣乳桿菌ZW3與突變株的基因組為模板，PCR擴(kuò)增基因片段WANG_1108，基因WANG_1108與質(zhì)粒pET28a均用限制性內(nèi)切酶BamHI、HindIII雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下16 ℃過夜連接。將連接體系熱激轉(zhuǎn)化入已制備好的E. coli DH5α感受態(tài)中，形成E. coli DH5α轉(zhuǎn)化子。在進(jìn)行PCR和雙酶切驗證之后，送金唯智基因公司測序驗證堿基發(fā)生突變情況。

驗證無誤后，將重組質(zhì)粒以同樣的方法轉(zhuǎn)至表達(dá)菌株E. coli BL21（DE3），利用含有卡那霉素抗性平板篩選轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子在37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜，次日以2%的接種量接種到100 mL新鮮的自誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，同時以含有pET28a質(zhì)粒的E. coli BL21（DE3）作為對照。

1.3.5 STPKs活性的測定

以1.3.4節(jié)的方法過夜誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，使用STPKs酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行酶活性測定。向96 孔板中加入試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)樣品，按說明書要求依次進(jìn)行溫育、洗滌、加酶、洗滌、顯色，最終根據(jù)450 nm波長處吸光度進(jìn)行酶活性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌EPS產(chǎn)量

以4%的接種量將野生菌L. kefiranofaciens ZW3和突變株2#的種子液接種到新鮮改良MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃厭氧培養(yǎng)。野生菌株ZW3的EPS產(chǎn)量在培養(yǎng)56 h時達(dá)到最高值，為2 080.53 mg/L，突變株2#的EPS產(chǎn)量在培養(yǎng)72 h時達(dá)到最高值，為1 230.3 mg/L，同野生菌株相比，EPS產(chǎn)量降低了40%，且時間滯后。

2.2 突變株2#的全基因組測序及與野生菌株ZW3基因組分析比對結(jié)果

為深入研究突變株2#產(chǎn)糖量下降且時間滯后的原因，對突變株2#進(jìn)行基因組重測序，并同野生菌株ZW3全基因組序列進(jìn)行BLAST比對。通過突變株2#基因組重測序，發(fā)現(xiàn)其16S rRNA與野生菌株的16S rRNA相似性為100%。這一結(jié)果證實了菌株2#確實為馬乳酒樣乳桿菌ZW3的突變株，并為后續(xù)分析突變株2# EPS產(chǎn)量下降的原因與基因突變之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

對野生菌株和突變株進(jìn)行全基因組比對分析發(fā)現(xiàn)，在CDS區(qū)和啟動子區(qū)發(fā)生突變的基因共60 個，多糖基因簇并未發(fā)生突變，發(fā)生突變的基因中相關(guān)催化反應(yīng)酶類有6 個（表2），這6 個基因通過BLAST比對和Pfam數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測功能，分別為：WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175（WANG_0173、WANG_0175均為編碼二羥丙酮激酶或其亞基部分）、WANG_1108（STPKs）、WANG_0292（β-半乳糖苷酶小亞基）、WANG_0840（UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶），其中WANG_0292發(fā)生了同義突變。

表2 與催化反應(yīng)相關(guān)的突變基因Table 2 Mutant genes associated with catalytic reactions

2.3 與產(chǎn)EPS相關(guān)突變基因的RT-qPCR分析結(jié)果

2.3.1 RT-qPCR引物特異性及擴(kuò)增效率

以cDNA為模板，驗證表1所合成引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1所示，8 個擴(kuò)增產(chǎn)物均為單一條帶，且片段大小與設(shè)計的大小相符，也不存在引物二聚體。實驗分析表明所設(shè)計的引物具有良好特異性。

圖1 RT-qPCR產(chǎn)物Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of RT-qPCR product

分析定量時一般取內(nèi)參循環(huán)值15～35。為正確評估PCR擴(kuò)增效率，至少做5 個數(shù)量級倍數(shù)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。當(dāng)R2值大于0.99時，2 個數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。由表3可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與PCR擴(kuò)增效率分別在-3.5～-3、90%～120%范圍內(nèi)。以野生菌ZW3和突變株2#的cDNA為模板，進(jìn)行10 倍比稀釋，稀釋系列為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，繪制各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明線性關(guān)系良好。

表3 RT-qPCR引物的相關(guān)參數(shù)Table 3 Related parameters with different primers

2.3.2 突變基因RT-qPCR分析結(jié)果

RT-qPCR是指在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，通過熒光信號累計實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法[23]，分為絕對定量與相對定量，其中在研究中應(yīng)用更為廣泛的為相對定量分析方法[24]。相對定量分析方法是比較2 個或2 個以上樣本中某個基因表達(dá)量的變化，關(guān)注的是基因的相對表達(dá)量。2-ΔΔCt方法是相對定量分析中最經(jīng)典的方法[25]。

以野生菌ZW3和突變株2#各時間點的cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR實驗，采用的染料為目前最常用的能與雙鏈DNA小溝部位結(jié)合、具有綠色激發(fā)波長的SYBR Green I染料。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，得出5 個突變基因在不同時間的相對表達(dá)量，結(jié)果如圖2所示。

圖2 各基因在不同時間的相對表達(dá)量Fig. 2 Relative expression level of each gene at different times

由圖2可以看出，5 個基因相對表達(dá)量累加值從小到大順序為WANG_0174＜WANG_0840＜WANG_1108＜WANG_0175＜WANG_0173。在72 h時，各基因的相對表達(dá)量均達(dá)到最低，尤其WANG_0174相對表達(dá)量僅為1%，其他基因中最大的表達(dá)量也僅為26%。

WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175均為編碼二羥丙酮激酶或其亞基部分，由圖2可以看出，其中WANG_0173、WANG_0175在各時間點基因相對表達(dá)量趨勢大體一致，而WANG_0174除了在48 h時相對表達(dá)量為113%，其余4 個時間點相對表達(dá)量均不到60%，尤其在72 h時相對表達(dá)量僅為1%。

由圖2d、e可以看出，WANG_0840與WANG_1108除了在120 h相對表達(dá)量等于或大于對照組，其余4 個時間點表達(dá)量均下調(diào)，但是在72 h時，WANG_1108相對表達(dá)量小于WANG_0840。結(jié)合上述基因組分析比較結(jié)果，WANG_1108 STPKs可以使蛋白質(zhì)氨基酸殘基發(fā)生磷酸化，從而影響酶的結(jié)構(gòu)和催化活性，在EPS合成代謝途經(jīng)中有著關(guān)鍵作用，因此，選取該基因進(jìn)一步闡明與EPS產(chǎn)量的關(guān)系。

2.4 重組質(zhì)粒pET28a-ZW3/2#-1108的構(gòu)建結(jié)果

2.4.1 擴(kuò)增基因片段

從野生菌ZW3與其突變株2#中提取染色體DNA，以此作為模板，擴(kuò)增這2 株菌的基因WANG_1108片段，由圖3可知，得到與表1中對應(yīng)大小的條帶。

圖3 ZW3/2#-1108 PCR產(chǎn)物Fig. 3 PCR products of ZW3/2#-1108

2.4.2 重組質(zhì)粒驗證結(jié)果

重組質(zhì)粒大小為7 652 bp，利用熱激轉(zhuǎn)化的方法將連接體系轉(zhuǎn)入E. coli DH5α中，37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，利用含有卡那霉素抗性的平板篩選轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗證，并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證，結(jié)果如圖4所示。

圖4 雙酶切驗證圖Fig. 4 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

由圖4可知，酶切目的條帶均在對應(yīng)大小位置處，且測序結(jié)果表明構(gòu)建的質(zhì)粒與原基因相似度為100%。

2.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活性測定結(jié)果

2.5.1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)至表達(dá)菌株E. coli BL21（DE3）

將重組質(zhì)粒pET28a-ZW3/2#-1108轉(zhuǎn)到表達(dá)菌株E. coli BL21（DE3）中，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，如圖5所示，部分泳道在2 000 bp附近有條帶出現(xiàn)，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。

圖5 WANG_1108轉(zhuǎn)化子PCR驗證圖Fig. 5 PCR identification of WANG_1108 transformants

2.5.2 重組子蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及STPKs活性測定結(jié)果

2.5.2.1 重組子蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

在有利于pET系列重組質(zhì)粒表達(dá)的自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行蛋白表達(dá)，經(jīng)過氨基酸序列基本理化特性分析得到：基因WANG_1108蛋白分子質(zhì)量大小為87.7 kDa，且不具有信號肽。所以通過離心收集菌體重新懸浮破碎檢測上清液來判斷蛋白是否表達(dá)。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，在大約87 kDa處檢測到WANG_1108編碼的蛋白條帶（圖6）。

圖6 蛋白表達(dá)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the expressed protein

2.5.2.2 STPKs活性測定結(jié)果

按照1.3.6節(jié)方法，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.012 5x＋0.038 7，R2為0.995。

本實驗所用的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫分析具有較高的靈敏度，通過測定，野生菌株ZW3中的STPKs活性為0.223 U/mL，突變株2#為0.14 U/mL，酶活性比野生菌株降低了37%，STPKs的活性減弱，會使EPS產(chǎn)量降低。可能的原因是菌株整體磷酸化水平降低，與多糖合成的相關(guān)酶類如糖原磷酸化酶活性減弱。

3 結(jié) 論

本研究以西藏kefir粒中分離得到的高產(chǎn)EPS的馬乳酒樣乳桿菌ZW3為研究對象。首先用苯酚-硫酸法對野生菌株與低產(chǎn)糖量突變株進(jìn)行EPS產(chǎn)量的測定，發(fā)現(xiàn)突變株2#的EPS產(chǎn)量最高值為1 230.3 mg/L，產(chǎn)量比野生菌株降低了40%。經(jīng)全基因組比對分析發(fā)現(xiàn)6 個編碼相關(guān)催化反應(yīng)酶類的基因發(fā)生了突變，分別為：WANG_0173、WANG_0174、WANG_0175（3個基因均編碼二羥丙酮激酶亞基部分）、WANG_1108（STPKs）、WANG_0292（β-半乳糖苷酶小亞基）、WANG_0840（UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶），其中WANG_0292發(fā)生了同義突變。通過分析二羥丙酮激酶、STPKs和UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶在代謝通路中的作用，發(fā)現(xiàn)這3 個酶可能會影響EPS產(chǎn)量發(fā)生變化。

首先，二羥丙酮激酶參與甘油的代謝，具有磷酸化的作用，且具有磷酸烯醇式丙酮酸-甘油磷酸轉(zhuǎn)移酶的活性[26-28]。該酶可以催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸的反應(yīng)，進(jìn)入糖酵解的最后一步，參與糖酵解的過程，糖酵解過程中的生成物又可以通過糖異生途徑再次生成葡萄糖，影響了EPS前體物質(zhì)UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖的合成，進(jìn)而會影響了EPS的合成。

其次，STPKs可以使蛋白質(zhì)氨基酸羥基磷酸化，影響酶的結(jié)構(gòu)和催化活性，在各方面發(fā)揮重要作用[29-31]。比如：糖原磷酸化酶催化糖原分解成葡萄糖-1-磷酸，但是糖原磷酸化酶分為2 種，一種是高活力磷酸化酶a，另一種是低活力磷酸化酶b，磷酸化酶a由2 個亞基構(gòu)成，每個亞基上有一個特定的羥基通過STPKs作用被磷酸化，促進(jìn)糖原磷酸化酶發(fā)揮最大活性。另一個和糖原合成有關(guān)的酶，糖原合酶（b），是糖原合成的限速酶，其被STPKs磷酸化后，活性和糖原磷酸化酶相反，活性會被抑制。由以上分析可知，如果STPKs發(fā)生突變，活性減弱或消失，隨之糖原磷酸化酶不能被磷酸化，糖原分解受阻，糖原分解產(chǎn)物葡萄糖-1-磷酸含量減少，進(jìn)而UDP-葡萄糖合成量減少。而糖原合酶與糖原磷酸化酶正相反，其未被磷酸化后，活性增加，促進(jìn)糖原合成，糖原合成底物UDP-葡萄糖含量減少。綜合以上分析，如果STPKs發(fā)生突變活性減弱或消失，作為EPS合成的前體物質(zhì)UDP-葡萄糖合成量會下降，EPS產(chǎn)量也會隨著降低。

最后，細(xì)胞壁對EPS產(chǎn)量也會起到一定作用。在革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁組成成分中，肽聚糖占主導(dǎo)地位[32]。肽聚糖的合成過程分為：合成N-乙酰胞壁酸五肽（“Park”核苷酸）；雙糖肽亞單位的形成；雙糖肽交聯(lián)形成肽聚糖。其中UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶作用于肽聚糖單體合成的第1步，催化D-谷氨酸與UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸的連接[33]。通過對肽聚糖單體合成的影響進(jìn)而影響細(xì)胞壁的合成，而細(xì)胞壁對菌體有保護(hù)、支持以及協(xié)助細(xì)胞分裂等重要作用，所以，菌體的生長及一些生理功能也會受到影響。

由以上分析可知，二羥丙酮激酶、STPKs、UDP-N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸/D-谷氨酸連接酶分別通過參與糖酵解過程、糖原合成與分解中糖原磷酸化酶與糖原合酶的磷酸化、細(xì)胞壁合成影響調(diào)控EPS的產(chǎn)量。

通過RT-qPCR分析突變基因相對表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)各基因的相對表達(dá)量均有不同程度的下降，選取變化較顯著的WANG_1108基因?qū)ζ溥M(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-ZW3/2#-1108并構(gòu)建E. coli表達(dá)菌株，進(jìn)一步闡明與EPS產(chǎn)量的關(guān)系。誘導(dǎo)表達(dá)檢測酶活性發(fā)現(xiàn)，突變株中STPKs活性比野生菌降低了37%，表明編碼STPKs的基因WANG_1108的突變與EPS產(chǎn)量的降低有一定的關(guān)系。