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      直接競爭ELISA法檢測蜂蜜中氯霉素殘留

      2018-08-31 02:32:50韋倩妮楊金易孫遠(yuǎn)明徐振林李向梅雷紅濤
      食品科學(xué) 2018年16期
      關(guān)鍵詞:包被稀釋液倍數(shù)

      劉 姚,韋倩妮,王 弘,楊金易,孫遠(yuǎn)明,徐振林,沈 興,李向梅,雷紅濤*

      氯霉素(chloramphenicol,CAP)又稱氯胺苯醇,是一種常用的廣譜抗生素,結(jié)構(gòu)式如圖1所示。1947年,在Streptomyces Venezuelae的培養(yǎng)液中首次分離得到CAP[1],其抑菌機(jī)制是通過與原核細(xì)胞內(nèi)的50S核糖體亞基結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)的合成從而抑制微生物的生長繁殖[2]。CAP具有抗菌效果明顯、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn),因此廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)中,治療畜禽腸道感染疾病[3]。近年來,許多研究表明CAP的過度攝入會(huì)威脅人類健康,國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將CAP歸為2A組,表明CAP或許對人類致癌;CAP還能抑制人體的造血系統(tǒng),引起血細(xì)胞減少、灰嬰綜合癥和再生障礙性貧血[4]。因此,歐盟、美國、日本等國家和地區(qū)均規(guī)定在食品中禁止使用CAP[5]。歐盟設(shè)定在肉類、雞蛋、牛奶、水產(chǎn)品和蜂蜜中CAP的最低要求的性能限制為0.3 μg/kg[6]。然而CAP的違規(guī)使用依然廣泛存在,為有效監(jiān)控食品中CAP的含量,有必要對CAP進(jìn)行嚴(yán)格的檢測。

      圖1 CAP分子結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of chloramphenicol

      蜂蜜作為一種天然的甜味劑,廣泛用作營養(yǎng)品[7]。有研究表明,蜂蜜富含酚醛樹脂、揮發(fā)性物質(zhì)、有機(jī)酸、丙酮醛、過氧化氫酶等,具有抗菌抗氧化活性[8]。與其他天然食品一樣,蜂蜜容易受到環(huán)境的污染,如重金屬、農(nóng)藥、抗生素污染。常用于檢測蜂蜜中CAP的方法有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9-12]、氣相色譜[13]等,雖然靈敏度高,但是儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜,且不適用于大量樣品的篩查。近年來基于抗原-抗體特異性識別的基礎(chǔ)上發(fā)展的免疫檢測方法有表面等離子共振[14-16]、免疫傳感器[17-19]、免疫層析試紙條[20]、多點(diǎn)納米矩陣[21]、光敏比色免疫測定[22]等廣泛用于蜂蜜中CAP的檢測。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)因其操作簡便被廣泛用于樣品初分析和現(xiàn)場篩查[7]。

      中國是世界上最大的蜂蜜生產(chǎn)、消費(fèi)和出口國,2015年國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)顯示中國產(chǎn)蜂蜜達(dá)50萬 t,其中出口量占28.6%,國內(nèi)消費(fèi)占69.3%。為保障消費(fèi)者健康安全和蜂蜜出口貿(mào)易的順利進(jìn)行,亟需研究開發(fā)蜂蜜中CAP高靈敏度快速檢測試劑盒。目前,國外普遍采用商業(yè)化的直接競爭ELISA試劑盒對CAP殘留進(jìn)行檢測,直接競爭ELISA具有靈敏度高和操作簡單的優(yōu)點(diǎn);常用的試劑盒主要來源于德國r-Biopharm公司、英國RANDOX公司及荷蘭Euro-Diagnostica公司[23]。國內(nèi)關(guān)于CAP的殘留ELISA檢測試劑盒的研發(fā),主要集中在間接ELISA試劑盒,僅有少數(shù)是直接競爭法ELISA試劑盒[24];直接競爭法ELISA采用的包被原有羊抗兔IgG抗體(二抗)[25]和CAP單克隆抗體[26]。本研究在已獲得高特異性CAP單克隆抗體的基礎(chǔ)上,對CAP直接競爭ELISA方法進(jìn)行優(yōu)化,為進(jìn)一步研制蜂蜜中CAP殘留直接競爭ELISA檢測試劑盒提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      抗CAP單克隆抗體、CAP-辣根過氧化物酶標(biāo)記物、3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB)由廣東省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存;蜂蜜(經(jīng)儀器檢測不含CAP) 市購;CAP標(biāo)準(zhǔn)品上海孟成科技有限公司;羊抗鼠IgG 武漢博士德生物公司;96 孔可拆卸酶標(biāo)板 廈門美宜佳公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

      包被液:Na2CO31.69 g和NaHCO32.95 g,用蒸餾水定容至1 L;抗體稀釋液:PBST(含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS));底物顯色液:TMB顯色液;終止液為10%硫酸溶液;洗液:Na2HPO4·12H2O 3.0 g、NaCl 8.5 g、吐溫20 0.5 mL,用蒸餾水定容至1 L;磷酸鈉緩沖液(phosphate buffer,PB)、PBS和硼酸緩沖液(硼液)均由實(shí)驗(yàn)室配制。

      1.2 儀器與設(shè)備

      Multiskan酶標(biāo)儀、Wellwash 4MK2洗板機(jī) 美國Thermo公司;6K-15冷凍離心機(jī) 美國Sartorius-Sigma公司;82-5控溫磁力攪拌器 金壇市恒豐儀器廠;DK-8D電熱恒溫水槽 上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠;R2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 無錫申科生物技術(shù)有限公司;HY-4調(diào)速多用振蕩器 金壇市順華儀器有限公司;KQ-50DA型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

      1.3 方法

      1.3.1 直接競爭ELISA基本步驟

      包被:用包被液將包被抗體稀釋到合適濃度,加入96 孔板中,100 μL/孔,孵育過夜。封閉:使用洗液洗板2 次,拍干,每孔加入120 μL封閉液,37 ℃孵育3 h,甩干孔中的液體,置于37 ℃烘箱中1 h備用??乖?抗體反應(yīng):每孔各加入50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品與50 μL的酶標(biāo)記抗原,37 ℃水浴孵育一定時(shí)間。洗板:用洗滌液洗滌6 次。加底物液:每孔各加入底物液緩沖液50 μL和底物液50 μL,顯色10 min。終止反應(yīng):每孔各加入終止液50 μL,在酶標(biāo)儀上測量波長450 nm處各孔吸光度。

      1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的確定

      用不同稀釋液(去離子水、PBST、PBS、PB液)配制CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度分別為0.000、0.005、0.015、0.045、0.135、0.405、1.215、3.645、10.935、32.805、98.415 ng/mL和295.245 ng/mL。按照1.3.1節(jié)步驟進(jìn)行測定,以CAP標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度負(fù)對數(shù)為橫坐標(biāo),以A450nm為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.3.3 包被溫度的確定

      分別在4 ℃和37 ℃包被過夜(12 h)。按照1.3.1節(jié)步驟測定,選擇靈敏度較高、曲線斜率較大的溫度為最佳包被溫度。

      1.3.4 包被抗體稀釋倍數(shù)的確定

      將包被抗體分別稀釋不同倍數(shù)(1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000),于4 ℃包被過夜。按照1.3.1節(jié)步驟測定A450nm,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.3.5 酶標(biāo)抗原稀釋液的確定

      分別使用PBST、PB液與硼液稀釋酶標(biāo)抗原,測定A450nm,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.3.6 酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)確定

      將酶標(biāo)抗原分別按1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000稀釋倍數(shù)加入到酶標(biāo)孔中,按1.3.1節(jié)步驟測定,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.3.7 競爭時(shí)間的確定

      按照1.3.1節(jié)步驟,在加入藥物與酶標(biāo)抗原后,于37 ℃分別競爭反應(yīng)20、25、30、40 min后顯色,測定A450nm,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.3.8 直接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

      由以上ELISA條件優(yōu)化過程確定出各個(gè)因素的最佳值,按照1.3.1節(jié)步驟測定A450nm,以CAP標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度負(fù)對數(shù)為橫坐標(biāo),以A450nm為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      1.3.9 樣品前處理方法的優(yōu)化

      1.3.9.1 提取方法的優(yōu)化

      振蕩提?。悍Q取蜂蜜樣品3 g,加3 mL蒸餾水,振蕩均勻,再加6 mL乙酸乙酯,振蕩15 min。5 000 r/min離心10 min。吸取上層液2 mL。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干,加1 mL正己烷溶解殘留物,再加1 mL PBS復(fù)溶。去除上層正己烷,取下層清液50 μL待測。

      超聲提?。悍Q取樣品3 g,加3 mL蒸餾水,振蕩均勻,再加6 mL乙酸乙酯,超聲15 min。5 000 r/min離心10 min。吸取上層2 mL。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干,加1 mL正己烷溶解殘留物,再加1 mL PBS復(fù)溶。去除上層正己烷,取下層清液50 μL待測。

      1.3.9.2 提取時(shí)間的確定

      稱取樣品3 g,共設(shè)4 組。每組加3 mL蒸餾水,振蕩均勻,再加6 mL乙酸乙酯,然后每組分別振蕩5、10、20、30 min。5 000 r/min離心10 min。吸取上層2 mL。45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干,加1 mL正己烷溶解殘留物,再加1 mL PBS復(fù)溶。去除上層正己烷,取下層清液50 μL待測。

      1.3.10 蜂蜜樣品中CAP的檢出限和定量限

      取20 份空白樣品,按照已確定的步驟進(jìn)行測定,計(jì)算檢出質(zhì)量濃度的平均值C0以及標(biāo)準(zhǔn)偏差SC0。檢出限為C0加上3 倍的SC0,定量限為C0加上10 倍的SC0。

      1.3.11 添加回收實(shí)驗(yàn)

      在樣品中添加不同水平(0.3、1、3 ng/mL)的CAP標(biāo)準(zhǔn)品,按照樣品前處理方法對樣品進(jìn)行處理。分別按照已優(yōu)化的方法進(jìn)行ELISA檢測,并計(jì)算回收率。

      1.3.12 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

      對于所建立CAP的ELISA檢測方法進(jìn)行重復(fù)性考察,分別以批內(nèi)與批間誤差來表示。批內(nèi)變異測定:每一標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度作8 次重復(fù),以其批內(nèi)變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差;批間變異測定:按照最佳檢測條件分別作標(biāo)準(zhǔn)曲線,取不同批次包被的酶標(biāo)板,每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度每天作一次分析,連續(xù)進(jìn)行7 d測定,綜合7 d測得質(zhì)量濃度進(jìn)行分析,以其批間變異系數(shù)表示批間誤差。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 最佳反應(yīng)條件

      2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的確定

      圖2 CAP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of dilution of chloramphenicol standard

      如圖2所示,使用蒸餾水或者PB溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí),A450nm值偏低,而用PBS或PBST可提高A450nm值,且使用PBS時(shí),IC50值低而Amax/IC50高,可能原因是PBS溶液具有一定離子強(qiáng)度,有較好的緩沖能力,使用其作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液進(jìn)行ELISA反應(yīng)時(shí),不會(huì)破壞緩沖體系的pH值和離子濃度,因此選擇PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品檢測效果最佳。

      2.1.2 包被溫度的確定

      圖3 包被溫度的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of coating temperature

      如圖3所示,采用4℃包被過夜,A450nm值和Amax/IC50較高,并且比37 ℃包被更靈敏??贵w在37 ℃包被過程中,由于孵育時(shí)間偏長,部分蛋白變性,而4 ℃長時(shí)間孵育更有利與抗體充分吸附到固相載體上并保持抗體活性,因此選擇4 ℃為最佳的包被溫度。

      2.1.3 包被抗體稀釋倍數(shù)的確定

      圖4 抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of antibody dilution

      如圖4所示,當(dāng)包被抗體稀釋倍數(shù)達(dá)到1∶4 000時(shí),隨著稀釋倍數(shù)的提高,曲線靈敏度并沒有明顯變化,但A450nm值和Amax/IC50值逐漸降低,因此,選擇1∶4 000作為包被抗體最佳稀釋倍數(shù)。

      2.1.4 酶標(biāo)抗原稀釋液的確定

      如圖5所示,用PBST稀釋酶標(biāo)記抗原,其檢測值較低,但靈敏度和Amax/IC50最高,而其余2 種稀釋液效果相當(dāng),可能原因是PBST的成分對于非特異性蛋白的競爭性結(jié)合的抑制作用更為明顯,故選擇PBST作為抗體稀釋緩沖液。

      圖5 酶標(biāo)抗原稀釋液的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of dilution solution for enzyme labeled antigen

      2.1.5 酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)的確定

      圖6 酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)的優(yōu)化Fig. 6 Optimization of dilution degree of enzyme labeled antigen

      如圖6所示,隨著酶標(biāo)記抗原稀釋倍數(shù)的提高,A450nm值和IC50值降低,Amax/IC50升高。當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到1∶4 000時(shí),各個(gè)參數(shù)達(dá)最佳水平。因此酶標(biāo)記抗原最佳稀釋倍數(shù)為1∶4 000。

      2.1.6 競爭時(shí)間的確定

      圖7 競爭時(shí)間的優(yōu)化Fig. 7 Optimization of competition time

      如圖7所示,隨著競爭時(shí)間延長,檢測值隨時(shí)間的延長呈平穩(wěn)上升趨勢,Amax/IC50先升高再降低,在25 min處達(dá)到最高值。IC50值變化較為顯著,在20~20 min內(nèi)IC50值較低,但此后隨競爭時(shí)間延長,IC50值急劇升高。因此ELISA反應(yīng)最佳競爭時(shí)間為25 min。

      2.1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

      按照上述ELISA條件優(yōu)化結(jié)果,得到CAP直接競爭ELISA方法的最佳反應(yīng)條件,即:包被抗體稀釋倍數(shù)1∶4 000,包被溫度4 ℃,酶標(biāo)記抗原稀釋緩沖液為PBST,稀釋倍數(shù)1∶4 000,最佳競爭時(shí)間25 min。

      根據(jù)波長450 nm處吸光度,以CAP標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度負(fù)對數(shù)為橫坐標(biāo),以A450nm為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-17.425x+97.509,相關(guān)系數(shù)R2為0.991 2,IC50為0.63 ng/mL。線性范圍(IC20~I(xiàn)C80)為0.10~4.17 ng/mL。

      2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

      2.2.1 提取方式的確定結(jié)果

      表1 蜂蜜不同提取方式添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recoveries of chloramphenicol from honey samples using different extraction methods

      如表1所示,采用超聲提取和振蕩提取2 種方式提取樣品中的CAP,提取得率相差不大。振蕩提取更為簡便,因此確定振蕩提取為樣品前處理方式。

      2.2.2 提取時(shí)間的確定結(jié)果

      表2 不同提取時(shí)間添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recoveries of chloramphenicol from spiked honey samples with different extraction times

      如表2所示,不同提取時(shí)間條件下,樣品的添加回收率均在90%~120%之間。5 min已可將樣品中的CAP幾乎完全提取出來。組織樣品等其他樣品的基質(zhì)成分較蜂蜜更為復(fù)雜,為確保盡可能完全提取出各類樣品中的CAP,又不至于使處理時(shí)間過長,故選擇提取時(shí)間為10 min。

      2.3 方法確證

      2.3.1 蜂蜜樣品中CAP的檢出限和定量限結(jié)果

      按照ELISA條件優(yōu)化結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)選取20 份空白蜂蜜樣品,按照直接競爭ELISA方法測定。蜂蜜樣品的檢出限和定量限分別為0.15 ng/g和0.33 ng/g。

      2.3.2 準(zhǔn)確度結(jié)果

      本實(shí)驗(yàn)對蜂蜜樣品中CAP添加回收進(jìn)行測定,如表3所示。選取3 個(gè)添加水平,分別為0.3、1 ng/g和3 ng/g,其回收率分別為100.94%、100.81%和97.58%,且批間和批內(nèi)變異系數(shù)均小于11%,表明該方法準(zhǔn)確度高。

      表3 蜂蜜樣品CAP添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recovery and precision of chloramphenicol from spiked honey sample

      2.3.3 精密度結(jié)果

      如表4所示,當(dāng)CAP質(zhì)量濃度為0.1 ng/mL時(shí),變異較大,當(dāng)質(zhì)量濃度在0.3~8.1 ng/mL范圍內(nèi),變異系數(shù)均小于10%,表明該方法重復(fù)性較好。

      表4 批內(nèi)變異(n=8)Table 4 Inter-assay coefficients of variation of the standard curve (n = 8)

      表5 批間變異(n=7)Table 5 Inter-assay coefficients of variation of the standard curve (n = 7)

      如表5所示,不同時(shí)間內(nèi)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,IC50的變異系數(shù)均小于10%,表明所建立的方法重復(fù)性較好。

      3 討 論

      ELISA方法的建立往往需要對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化[27-31]。郭逸蓉等[24]利用抗氯霉素琥珀酸單酯多克隆抗體作為包被原,建立CAP殘留直接競爭ELISA檢測試劑盒;采用方陣實(shí)驗(yàn)法,對包被多克隆抗體和酶標(biāo)半抗原的稀釋度進(jìn)行優(yōu)化,研究結(jié)果表明:所建立的直接競爭ELISA試劑盒對CAP的檢測線(IC10)和線性范圍分別為0.47 ng/mL和0.24~250 ng/mL,在蝦肉、雞肉、蜂蜜和鮮奶中的檢測線為1~2 μg/kg,檢測反應(yīng)過程需要80 min左右。張立辰等[26]利用CAP單克隆抗體為包被原,優(yōu)化了樣品稀釋液的離子強(qiáng)度和pH值,建立海產(chǎn)品中CAP殘留直接競爭ELISA檢測方法,其檢測線IC15為(0.10±0.03) ng/mL,檢測反應(yīng)過程也需要80 min左右。Guo Lingling等[20]為建立CAP間接競爭ELISA檢測方法,對包被原、甲醇濃度、NaCl含量、pH進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明IC20~I(xiàn)C80為0.11~1.36 ng/mL。

      本實(shí)驗(yàn)對CAP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、包被溫度、包被抗體稀釋倍數(shù)、酶標(biāo)抗原稀釋液、酶標(biāo)抗原稀釋倍數(shù)和競爭時(shí)間6 個(gè)單因素進(jìn)行優(yōu)化,建立最優(yōu)CAP直接競爭ELISA方法,優(yōu)化后的反應(yīng)條件為:包被抗體稀釋倍數(shù)1∶4 000,包被溫度4 ℃,酶標(biāo)記抗原稀釋緩沖液為PBST,稀釋倍數(shù)1∶4 000,最佳競爭時(shí)間25 min。在此條件下,建立的ELISA方法檢出限可達(dá)(0.04±0.01) ng/mL,檢測范圍為0.10~4.17 ng/mL,檢測反應(yīng)時(shí)間需要40 min左右,滿足國內(nèi)外規(guī)定的CAP檢出限。同時(shí)蜂蜜空白樣品的檢出限和定量限分別是0.15 ng/g和0.33 ng/g,回收率分別為97.58%、100.81%和100.94%,滿足實(shí)際檢測的需要。與前人CAP直接競爭ELISA檢測方法相比,本研究所建立的方法檢測限更低、檢測反應(yīng)過程耗時(shí)更短。

      直接競爭ELISA法靈敏度高、操作簡單,可同時(shí)進(jìn)行大量樣品的檢測,非常適合現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本初篩。本研究建立的蜂蜜中CAP殘留直接競爭ELISA檢測方法,耗時(shí)短、靈敏度高,經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜、氣相色譜-質(zhì)譜等儀器法進(jìn)一步確定后,有望給直接競爭ELISA法試劑盒的商品化帶來理論參考依據(jù)。

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