基于電子鼻及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)川西高原4 種蜂蜜揮發(fā)性成分分析

陳廷廷，胡 瓊，唐 潔*，王秀梅，劉 波，陳 林

我國(guó)是蜂蜜生產(chǎn)大國(guó)，蜂蜜產(chǎn)量占世界蜂蜜產(chǎn)量的1/4以上，川西高原位于青藏高原東南邊緣，該地區(qū)環(huán)境污染少，日照時(shí)間長(zhǎng)，晝夜溫差大，蜜源豐富，主要有油菜、白刺、當(dāng)歸、黃芪等達(dá)17 個(gè)科屬的植物蜜源[1]。產(chǎn)自高寒山區(qū)與高原地帶的川西高原蜂蜜，其蜜質(zhì)濃稠，營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性成分含量高，除主要的糖類外，還有氨基酸、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、維生素及礦物質(zhì)等[2]，具有良好的消炎、殺菌和潤(rùn)膚等醫(yī)療保健功能[3]。因此，越來越多地受到消費(fèi)者的喜愛并被作為無公害純天然的安全食品進(jìn)行廣泛開發(fā)。

近年來蜂蜜市場(chǎng)需求量不斷增大，但國(guó)內(nèi)蜂蜜質(zhì)量難以保障，蜂蜜品質(zhì)良莠不齊，不僅有損消費(fèi)者的利益，對(duì)我國(guó)蜂蜜的出口創(chuàng)匯能力也有較大影響。而目前僅僅依靠傳統(tǒng)的感官判定方法評(píng)價(jià)蜂蜜品質(zhì)往往不夠客觀，因此尋求一種快速、靈敏的檢測(cè)方法尤為重要。蜂蜜的揮發(fā)性成分對(duì)其風(fēng)味有重要貢獻(xiàn)，分析蜂蜜中的揮發(fā)性成分，可以作為鑒別蜂蜜蜜源及品質(zhì)的一種方法[4]。國(guó)內(nèi)外蜂蜜揮發(fā)性成分研究較早，已有超過600 種揮發(fā)性物質(zhì)從不同蜂蜜中鑒別出來[5]，然而，有關(guān)川西高原蜂蜜揮發(fā)性成分研究報(bào)道甚少。且對(duì)蜂蜜揮發(fā)性成分的檢測(cè)主要采用單一檢測(cè)方法，如Huang Lingxia等[6]利用電子鼻鑒定了不同蜂蜜的植物來源；Uckun等[7]利用氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞聯(lián)用測(cè)定了黃芪和柑橘蜂蜜的芳香活性化合物；涂世等[8]利用氣相色譜-氫火焰化離子檢測(cè)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）技術(shù)對(duì)油菜蜂蜜揮發(fā)性成分進(jìn)行分析并建立了油菜單花蜜揮發(fā)性成分的指紋圖譜。而通過GC-MS和電子鼻與多變量數(shù)據(jù)分析區(qū)分不同蜜源蜂蜜的研究鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用電子鼻系統(tǒng)，對(duì)川西高原油菜蜂蜜、當(dāng)歸藥花蜜、白刺花蜜和山花蜜4 種不同蜜源蜂蜜進(jìn)行初步區(qū)分，再結(jié)合頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）與GC-MS檢測(cè)不同蜂蜜的揮發(fā)性成分，以期探明不同蜜源蜂蜜揮發(fā)性成分的差異，并找出4 種蜂蜜特征性揮發(fā)成分，旨在為蜂蜜種類鑒別、品質(zhì)研究以及川西高原蜂蜜的開發(fā)應(yīng)用等提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

表1 蜜源信息Table 1 Information of honeys tested in this study

本實(shí)驗(yàn)的蜂蜜樣品由四川紅草地農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，樣品信息見表1。

1.2 儀器與設(shè)備

75 μm PDMS/CAR萃取頭 北京康林科技有限公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；QP 2010 PLUS GC-MS儀 日本島津公司；PEN3便攜式電子鼻系統(tǒng) 德國(guó)Airsense公司。

1.3 方法

1.3.1 電子鼻檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取4.0 g蜂蜜樣品于50 mL螺旋塞樣品瓶中，加蓋密封，50 ℃加熱平衡10 min。電子鼻檢測(cè)載氣（合成干燥空氣）流速150 mL/min，數(shù)據(jù)采集時(shí)間150 s，延滯時(shí)間300 s，每組6 個(gè)平行[9-10]。

1.3.2 HS-SPME-GC-MS檢測(cè)

HS-SPME：將萃取頭于GC進(jìn)樣口老化30 min，溫度250 ℃。萃取條件為密封狀態(tài)60 ℃平衡30 min，插入萃取頭后60 ℃吸附30 min，迅速將萃取頭置于進(jìn)樣口250 ℃解吸2 min，進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件：DB-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃，程序升溫：起始溫度40 ℃，保持2 min；4 ℃/min升至80 ℃，保持2 min；10 ℃/min升至160 ℃，保持2 min；5 ℃/min升至200 ℃，保持2 min；20 ℃/min升至240 ℃，保持5 min。載氣He，流速1.2 mL/min，不分流進(jìn)樣。

MS條件：電子電離源，離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 55～500[11-12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Alpha SOFT V12軟件分別進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）；利用NIST譜庫對(duì)揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，并用峰面積歸一化法確定各種成分的相對(duì)含量；利用Origin 8.0軟件進(jìn)行成分種類統(tǒng)計(jì)；用Minitab 16軟件進(jìn)行特征揮性發(fā)物質(zhì)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 電子鼻對(duì)蜂蜜揮發(fā)性成分分析

2.1.1 PCA方法對(duì)4 種蜂蜜的電子鼻分析

4 種蜂蜜揮發(fā)性成分PCA結(jié)果如圖1所示，數(shù)據(jù)采集點(diǎn)所在的橢圓區(qū)域在PCA圖中有特定的分布區(qū)域但又有部分重疊，說明PCA法適用于不同蜂蜜樣品的成分分析。通過PCA得出，第1主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率為91.90%，第2主成分區(qū)分貢獻(xiàn)率為7.13%，2 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率超過99%，表明這2 個(gè)主成分代表了樣品的主要信息特征，可用于分析不同蜂蜜中揮發(fā)性成分的相關(guān)性。油菜蜂蜜與當(dāng)歸藥花蜜、白刺花蜜與山花蜜兩兩之間有部分重疊，表明它們之間有相似的揮發(fā)性成分；油菜蜂蜜、當(dāng)歸藥花蜜與白刺花蜜、山花蜜之間沒有重疊，表明前兩者與后兩者揮發(fā)性成分差別較大。

圖1 4 種蜂蜜揮發(fā)性成分PCA圖Fig. 1 Principal component analysis of aroma components in four kinds of honey

2.1.2 LDA方法對(duì)4 種蜂蜜的電子鼻分析

4 種蜂蜜的LDA如圖2所示，其判別式LD1和LD2的貢獻(xiàn)率分別為74.20%和16.94%，總貢獻(xiàn)率達(dá)91.94%，較好地反映了樣品的總體信息，且4 個(gè)蜂蜜品種沒有重疊，說明LDA分析可對(duì)4 種蜂蜜進(jìn)行區(qū)分，與Romano等[13]的研究結(jié)果一致。從各品種蜂蜜橢圓的距離來看，油菜蜂蜜與其他蜂蜜的距離較大，且在LD1軸上與其他蜂蜜顯著區(qū)分，這可能是由于油菜蜂蜜具有不同于其他3 種蜂蜜的特殊揮發(fā)性物質(zhì)，在LDA中被識(shí)別。Dymerski等[14]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LDA是一種能更好地評(píng)估蜂蜜植物來源的工具，利用電子鼻結(jié)合LDA可以完全區(qū)分不同波蘭蜂蜜樣品的類型，本實(shí)驗(yàn)中，相比PCA，LDA對(duì)不同蜂蜜電子鼻分析結(jié)果較好，LDA技術(shù)能夠減少電子鼻響應(yīng)中觀察到的漂移效應(yīng)，因此，LDA能提高分類的精度。

圖2 4 種蜂蜜揮發(fā)性成分LDA圖Fig. 2 Linear discriminant analysis of aroma components in four kinds of honey

2.2 HS-SPME-GC-MS對(duì)蜂蜜揮發(fā)性成分分析

2.2.1 4 種蜂蜜揮發(fā)性成分總離子流圖及成分統(tǒng)計(jì)

電子鼻可以對(duì)樣品的整體風(fēng)味進(jìn)行分析檢測(cè)，能更直觀地反映不同蜜源蜂蜜的相似性，但不能對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的具體種類和含量進(jìn)行分析[15-16]，為進(jìn)一步對(duì)不同蜂蜜揮發(fā)性成分進(jìn)行測(cè)定，采用HS-SPME-GC-MS對(duì)油菜蜂蜜、當(dāng)歸藥花蜜、白刺花蜜和山花蜜4 種蜂蜜揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合NIST譜庫聯(lián)機(jī)檢索，最終分別鑒定出揮發(fā)性成分40、51、39 種和46種，采用峰面積歸一化法得到4 種蜂蜜鑒定出的化合物占總易揮發(fā)成分總量分別為98.72%、97.23%、95.86%、91.62%，其總離子流色譜圖如圖3所示，可以看出不同蜂蜜揮發(fā)性成分相對(duì)含量有所不同。

圖3 4 種蜂蜜揮發(fā)性成分的總離子色譜圖Fig. 3 Total ion chromatogram of aroma components of four kinds of honey

2.2.2 主要揮發(fā)性成分分析

對(duì)4 種蜂蜜主要揮發(fā)性成分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各主要成分及相對(duì)含量見表2。

表2 不同蜜源蜂蜜揮發(fā)性成分及相對(duì)含量Table 2 Volatile components and relative contents of different kinds of honey

續(xù)表2

續(xù)表2

由表2可知，4 種川西高原蜂蜜的揮發(fā)性成分種類及含量均存在較大差異，從4 種蜂蜜樣品中共檢測(cè)出123 種揮發(fā)性成分，其中醇類化合物36 種、酯類25 種、酮類13 種、醛類18 種、烴類31 種。對(duì)4 種蜂蜜的揮發(fā)性成分進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，如圖4所示，4 種蜂蜜中揮發(fā)性成分主要為醇類化合物，分別占總揮發(fā)性成分的74.8%、40.8%、71.28%、57.05%，這說明醇類在4 種蜂蜜揮發(fā)性成分中起重要作用，同時(shí)油菜蜂蜜中的醇類相對(duì)含量最高，但酮類物質(zhì)較少，張麗珍等[17]利用GC-MS檢測(cè)到的油菜蜂蜜中醇類物質(zhì)也最多，特別是乙醇，相對(duì)含量最高。當(dāng)歸藥花蜜含有酯類和酮類物質(zhì)較多，分別占總揮發(fā)性成分的23.00%、15.23%，白刺花蜜和山花蜜含有醛類物質(zhì)較多，分別占總揮發(fā)性成分的13.10%、16.72%，這與前人關(guān)于酯類和醛類物質(zhì)可作為蜂蜜香味主要來源的報(bào)道一致[18-19]。檢測(cè)到的醛類物質(zhì)中，糠醛、苯乙醛在油菜蜂蜜、白刺花蜜、山花蜜3 種蜂蜜中被檢出且相對(duì)含量較高，研究發(fā)現(xiàn)，糠醛、苯乙醛是不同蜂蜜風(fēng)味最重要的揮發(fā)性成分[6]。

4 種不同蜜源蜂蜜檢測(cè)到的共有物質(zhì)有7 種，分別是乙醇、異戊醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、芳樟醇、乙酸乙酯、甲基庚烯酮和右旋萜二烯，其中，芳樟醇、乙酸乙酯、甲基庚烯酮和右旋萜二烯被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工工業(yè)[20-21]。右旋萜二烯具有似鮮花的清淡香氣，呈甜橙和柑橘類風(fēng)味，在栗有志等[22]分析的4 種新疆蜂蜜、張麗珍等[17]分析的3 種江西蜂蜜以及任佳淼[23]分析的18 種寧夏等蜂蜜中均未被檢測(cè)出。研究發(fā)現(xiàn)，右旋萜二烯具有很好的抗癌活性[24]，對(duì)蜂蜜的生物醫(yī)學(xué)活性具有重要貢獻(xiàn)[25-26]，該活性物質(zhì)在川西高原蜂蜜中的檢出，可能對(duì)川西高原蜂蜜風(fēng)味的形成和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要的作用。

圖4 4 種蜂蜜揮發(fā)性成分種類的相對(duì)含量Fig. 4 Relative contents of volatile substance categories in four kinds of honey

運(yùn)用Minitab 16軟件對(duì)4 種蜂蜜的7 種共有揮發(fā)性成分進(jìn)行特征性物質(zhì)分析，相關(guān)矩陣特征值及特征向量如表3所示，由表3可知，前2 個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為95.8%，第1主成分貢獻(xiàn)率最高，為49.6%，主要綜合了異戊醇、甲基庚烯酮的含量信息；第2主成分貢獻(xiàn)率為46.2%，主要綜合了乙醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇的含量信息。因此，異戊醇、甲基庚烯酮、乙醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇對(duì)川西高原蜂蜜的揮發(fā)性成分具有重要影響，其含量可用作蜂蜜揮發(fā)性成分特點(diǎn)的評(píng)價(jià)。

表3 特征向量及累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvectors and cumulative contribution of variance

對(duì)4 種蜂蜜共有揮發(fā)性物質(zhì)種類進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，白刺花蜜與山花蜜有25 種相同物質(zhì)，油菜蜂蜜與當(dāng)歸藥花蜜有12 種相同物質(zhì)，說明它們之間揮發(fā)性成分的相似度較高，與電子鼻PCA結(jié)果基本一致。上述結(jié)果表明，GC-MS分析和電子鼻聯(lián)合PCA、LDA可以成功區(qū)分不同來源蜂蜜樣品的揮發(fā)性成分。

圖5 4 種蜂蜜共有揮發(fā)性成分種類分析Fig. 5 Analysis of volatile components common to four kinds of honey

Alissandrakis等[27]認(rèn)為當(dāng)某化合物是某種單花蜜中的特有成分，則此化合物是該單花蜜的特征性揮發(fā)物質(zhì)。研究表明，蜂蜜中的某些揮發(fā)性成分可以作為特征組分用以鑒定不同蜜源蜂蜜，在蜂蜜加工中，避免或降低特征風(fēng)味組分的損失可能會(huì)成為工藝改進(jìn)的一個(gè)重要出發(fā)點(diǎn)[28]。本研究分析檢測(cè)到的油菜蜂蜜、當(dāng)歸藥花蜜、白刺花蜜、山花蜜4種蜂蜜中特有揮發(fā)性成分分別有22、27、26 種和19 種，其中相對(duì)含量較多的揮發(fā)性成分分別有乙酸異戊酯（具有梨和香蕉的香味）、乙酸丁酯（有愉快果香氣味）、丙烯酸2-乙基己酯、四甘醇，這些化合物分別在4 種蜂蜜揮發(fā)性成分中起著重要作用，同時(shí)在任佳淼等[29]分析的馬占相思樹蜂蜜、Pattamayutanon等[30]分析的5 種蜂蜜（龍眼、向日葵、咖啡、野花、荔枝）以及Uckun等[7]分析的黃芪蜂蜜和柑橘蜂蜜的揮發(fā)性成分中未被檢出或檢出含量較少，因此可以確定這4 種揮發(fā)性成分為4 種蜂蜜的特征性揮發(fā)組分。

3 結(jié) 論

基于PCA、LDA方法的電子鼻檢測(cè)能很好地區(qū)分川西高原不同蜜源蜂蜜。HS-SPME-GC-MS鑒定出油菜蜂蜜、當(dāng)歸藥花蜜、白刺花蜜及山花蜜4 種蜂蜜中有7 種共有物質(zhì)，其中右旋萜二烯對(duì)川西高原蜂蜜風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有重要貢獻(xiàn)，異戊醇、甲基庚烯酮、乙醇、順-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇含量可用作川西高原蜂蜜揮發(fā)性成分特點(diǎn)的評(píng)價(jià)；特有揮發(fā)性成分可以作為特征組分用以鑒定特定蜂蜜的蜜源，川西高原4 種蜂蜜特有揮發(fā)性成分分別有22、27、26 種和19 種，其中含量較多的有乙酸異戊酯、乙酸丁酯、丙烯酸2-乙基己酯和四甘醇，可作為4 種蜂蜜的特征性揮發(fā)成分。通過電子鼻和GC-MS兩者結(jié)合，同時(shí)從宏觀和微觀上研究川西高原蜂蜜揮發(fā)性成分可為更好地開發(fā)和利用蜂蜜資源提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。