響應(yīng)面法和遺傳算法-神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型優(yōu)化微波萃取藍(lán)莓中花青素工藝

薛宏坤，劉成海，劉 釵，徐 浩，秦慶雨，沈柳楊，鄭先哲*

藍(lán)莓富含花青素和各種維生素，營養(yǎng)和保健價(jià)值高[1]，市場(chǎng)認(rèn)知度高，需求量大。花青素屬于多酚類物質(zhì)，是一種安全綠色的天然色素，可清除人體內(nèi)自由基[2]，具有抗氧化、防衰老、保護(hù)心腦血管和緩解視疲勞等功效[3-4]。從藍(lán)莓中高效萃取花青素是備受科研工作者關(guān)注的問題。目前對(duì)花青素的提取主要采用熱回流法，該方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑消耗量大、效率低等問題。然而微波具有穿透性強(qiáng)、選擇性高等特點(diǎn)。微波輔助萃取具有萃取得率高、過程易控制等特點(diǎn)[5]，微波輔助萃取原理是利用磁控管產(chǎn)生高頻電磁波直接穿透物料內(nèi)部，使物料內(nèi)部的極性分子隨微波頻率同步高速旋轉(zhuǎn)，離子快速移動(dòng)、瞬時(shí)摩擦生熱，使得物料內(nèi)的溫度迅速升高[6]。溶劑蒸發(fā)，產(chǎn)生壓力，當(dāng)產(chǎn)生的壓力超過細(xì)胞壁所承受的最大壓力，細(xì)胞壁破裂[7]。微波輔助萃取具有傳熱和傳質(zhì)同向特點(diǎn)，因此該技術(shù)用于從藍(lán)莓中萃取花青素，使花青素更容易從藍(lán)莓細(xì)胞擴(kuò)散到周圍溶劑中，從而達(dá)到提高萃取效率的目的[8]。

在藍(lán)莓微波輔助萃取花青素的過程中，微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比等因素對(duì)花青素萃取率都有一定影響，為了獲得高得率、高效率的萃取工藝，必須對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）是將建模和過程優(yōu)化集于一體的數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)技術(shù)[9]。該方法已在植物活性成分的提取優(yōu)化工藝方面得到廣泛的應(yīng)用[10-11]。但是RSM中的Box-Behnken設(shè)計(jì)是由旋轉(zhuǎn)的低維設(shè)計(jì)，所有試驗(yàn)設(shè)計(jì)均是3水平的組合試驗(yàn)，靈活性較差[12]。對(duì)試驗(yàn)點(diǎn)的選擇要求高，如果試驗(yàn)點(diǎn)的選擇不當(dāng)，則得不到理想的優(yōu)化結(jié)果[13]。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（artificial neural networks，ANN）具有卓越的并行處理、非線性、容錯(cuò)性、自學(xué)習(xí)、自適應(yīng)以及優(yōu)良的逼近能力，被廣泛應(yīng)用于生物堿[14]、花青素[15]以及VE[16]等提取加工工藝參數(shù)的優(yōu)化。與RSM相比，ANN具有從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中學(xué)習(xí)的能力，有效地處理非線性關(guān)系以及預(yù)測(cè)建模得出結(jié)論[17]，但ANN的權(quán)值和閾值確定具有一定的模糊性和缺乏規(guī)律性。遺傳算法（genetic algorithms，GA）具有全局尋優(yōu)和較強(qiáng)的魯棒性，將兩者結(jié)合可以達(dá)到較好的預(yù)測(cè)和優(yōu)化效果。遺傳算法-人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（GA-ANN）被應(yīng)用在微波浸提[18]、超臨界萃取[19]、花青素提取[20]、蛋白提取[21]等加工工藝參數(shù)的優(yōu)化。由于GA-ANN在數(shù)據(jù)擬合、預(yù)測(cè)和建模優(yōu)化等方面相比RSM，具有更高的靈活性和適應(yīng)性。為了探究適合于微波輔助萃取藍(lán)莓花青素工藝的優(yōu)化方法，有必要將2 種優(yōu)化方式進(jìn)行對(duì)比，最終達(dá)到優(yōu)化工藝參數(shù)的目的。

鑒于此，本研究通過單因素試驗(yàn)探究微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比對(duì)花青素萃取率的影響，并分析不同萃取條件下花青素的萃取特性。在此基礎(chǔ)上采用RSM和GA-ANN對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)比RSM和GA-ANN兩種優(yōu)化方式，最終確定最佳微波輔助萃取藍(lán)莓中花青素的工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓購自黑龍江哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，冷藏備用。

香草醛、濃鹽酸、甲醇、無水乙醇（均為分析純）天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-S型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MWS微波工作站 加拿大FISO公司；LG10-2.4A離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司；DK-98-IIA型恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；LAMBDA35型紫外-可見分光光度計(jì) 美國Perkin Elmer公司；TD-50凍干機(jī) 上海浦東冷凍干燥設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 材料預(yù)處理

挑選成熟度均一的藍(lán)莓，經(jīng)除雜、清洗、打漿，將果漿置于玻璃皿中，放在-18 ℃冰箱中將其冷凍12 h后，置于冷凍干燥機(jī)凍干24 h，然后用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過40 目篩，制成果粉，避光密封保存在4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 花青素的萃取

萃取體系的構(gòu)建：用分析天平準(zhǔn)確稱取2.000 0 g藍(lán)莓粉置于萃取容器中，加入預(yù)先確定體積和體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液作為萃取劑構(gòu)建萃取體系。微波萃取過程：將萃取容器置于微波工作站中央，微波工作站的示意圖如圖1所示，通過控制室設(shè)定微波的輸入功率和萃取時(shí)間，轉(zhuǎn)盤以14 r/min速率轉(zhuǎn)動(dòng)，目的是均勻加熱萃取液，用光纖溫度傳感器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)萃取液溫度變化，直到萃取結(jié)束。萃取體系渣液分離：經(jīng)微波處理后萃取體系倒入離心管中，置于離心機(jī)中以4 000 r/min離心15 min，將渣液和上清液均用60%乙醇溶液定容到100 mL的容量瓶，將上清液取出1 mL，放入10 mL具塞的比色管中，用60%乙醇溶液稀釋10 倍，然后從稀釋液中取出2 mL再放入10 mL具塞的比色管中，加入10 mL顯色劑（1%香草醛溶液與8%鹽酸溶液1∶1混合）水浴30 min，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的OD值，計(jì)算出花青素萃取率，從渣液中直接取2 mL放入10 mL具塞的比色管中，其他操作同上清液一致，計(jì)算花青素的殘留率和花青素降解率。

圖1 微波工作站示意圖Fig. 1 Schematic diagram of microwave workstation

1.3.3 花青素萃取率的計(jì)算

采用低濃度香草醛-鹽酸法[22]測(cè)定藍(lán)莓中花青素萃取率。在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定上清液的OD值，利用標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算出花青素濃度，方程如式（1）所示[23]：

式中：A為上清液OD值；C為花青素質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

通過式（1）計(jì)算出萃取液花青素質(zhì)量濃度，將其帶入到式（2）中計(jì)算出花青素萃取率：

式中：Y為花青素萃取率/%；V為定容體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；m為花青素總質(zhì)量/mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇作為提取溶劑，進(jìn)行微波提取。以2.000 0 g藍(lán)莓粉為提取對(duì)象，對(duì)微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比4 個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，討論其對(duì)花青素萃取率的影響。其中微波強(qiáng)度設(shè)50、100、150、200、250 W/g 5個(gè)水平；萃取時(shí)間設(shè)0、25、50、75、100 s 5 個(gè)水平；乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)40%、50%、60%、70%、80% 5 個(gè)水平；料液比設(shè)1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）5 個(gè)水平。所得數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.3.5 RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比為自變量，以花青素萃取率為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化出微波輔助萃取藍(lán)莓花青素的提取工藝。因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Coded and actual values of independent variables

采用RSM分析法得到的二次回歸模型如式（3）所示：

式中：b0為截距回歸系數(shù)；bi為線性回歸系數(shù)；bii為二次項(xiàng)的回歸系數(shù)；bij為交互項(xiàng)的回歸系數(shù)；Xi，Xj為自變量。

1.3.6 ANN模型的構(gòu)建

本研究采用3 層的ANN模型（輸入層、隱含層、輸出層）創(chuàng)建試驗(yàn)因素的優(yōu)化模型。選取微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比4 個(gè)變量作為網(wǎng)絡(luò)輸入層節(jié)點(diǎn)，并歸一化處理在0～1之間，歸一化法由式（4）計(jì)算可得：

式中：Ti為訓(xùn)練樣本數(shù)據(jù)的第i個(gè)輸入；Ti’為Ti歸一化后的數(shù)據(jù)，Ti∈’[a,b]；Timax為訓(xùn)練樣本數(shù)據(jù)的第i個(gè)輸入的最大值；Timin為訓(xùn)練樣本數(shù)據(jù)的第i個(gè)輸入的最小值。

花青素萃取率Y作為輸出層節(jié)點(diǎn)，各節(jié)點(diǎn)的活化函數(shù)為Sigmoid。確定網(wǎng)格的結(jié)構(gòu)。選用3-X-1結(jié)構(gòu)，隱含層神經(jīng)元X由公式（5）計(jì)算可得：

式中：p為隱含層神經(jīng)元數(shù)；n為輸入神經(jīng)元數(shù)；q為輸出層神經(jīng)元數(shù)；z為經(jīng)驗(yàn)值（1≤z≤10）。

圖2 微波萃取藍(lán)莓中花青素的ANN模型Fig. 2 ANN model of microwave extraction of anthocyanins in blueberries

圖3 訓(xùn)練花青素萃取率子集的網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練曲線Fig. 3 Network training curve for the yield of anthocyanins

ANN的結(jié)構(gòu)如圖2所示。選用優(yōu)化后的訓(xùn)練方案，對(duì)經(jīng)RSM得到的29 組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANN訓(xùn)練如圖3所示，目的使網(wǎng)格實(shí)現(xiàn)給定的輸入輸出映射關(guān)系。經(jīng)過測(cè)試樣本測(cè)試ANN模型性能，從而明確ANN模型。以均方根誤差（root mean square error，RMSE）、絕對(duì)平均偏差（absolute average deviation，AAD）和決定系數(shù)（R2）大小作為評(píng)價(jià)模型標(biāo)準(zhǔn)。RMSE和AAD越低，R2越高，則證明所建立的模型越穩(wěn)健。運(yùn)用AAD將RSM和ANN法2 種方式預(yù)測(cè)的花青素萃取率進(jìn)行比較。RMSE、AAD和R2表達(dá)式如式（6）～（8）所示：

式中：Yi,exp為花青素萃取率的實(shí)測(cè)值；i,exp為花青素萃取率實(shí)測(cè)值的平均值；Yi,cal為花青素萃取率的計(jì)算值；Ypredict為花青素萃取率的預(yù)測(cè)值；predict為花青素萃取率預(yù)測(cè)值的平均值；n為實(shí)驗(yàn)次數(shù)（29）。

1.3.7 最佳工藝參數(shù)優(yōu)化

網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練完成后，用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模擬優(yōu)化仿真，將ANN建模和遺傳優(yōu)化算法結(jié)合，優(yōu)化微波輔助萃取藍(lán)莓中花青素工藝參數(shù)，進(jìn)行全面仿真實(shí)驗(yàn)，即每個(gè)因素都在編碼范圍內(nèi)循環(huán)，利用GA-ANN模型仿真得到每組的花青素萃取率，將其與因素矩陣合并成一個(gè)大矩陣，再從這個(gè)矩陣中找出花青素萃取率最大所對(duì)應(yīng)的列，優(yōu)化出工藝參數(shù)及最大花青素萃取率的值。在優(yōu)化計(jì)算過程中，設(shè)定最大進(jìn)化代數(shù)為10 000，種群大小為5，交叉概率為0.6，變異概率為0.05，運(yùn)行Matlab軟件程序，得到每代種群最優(yōu)適應(yīng)度和平均適應(yīng)度及其變化結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)每一組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）；采用SAS 8.0軟件分析結(jié)果的顯著差異；SigmaPlot 12.5進(jìn)行單因素作圖；采用Design-Expert ver8.0軟件設(shè)計(jì)RSM；采用Matlab R2015b構(gòu)建ANN模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波萃取單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖4 微波強(qiáng)度（A）、萃取時(shí)間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）和料液比（D）對(duì)花青素萃取率的影響Fig. 4 Effects of microwave intensity (A), extraction time (B), ethanol concentration (C) and solid-to-solvent ratio(D) on the yield of anthocyanins

由圖4A可知，當(dāng)微波強(qiáng)度為50～150 W/g時(shí)，隨著微波強(qiáng)度的增加，花青素萃取率顯著增加（P＜0.05），微波強(qiáng)度為150 W/g時(shí)，花青素的萃取率達(dá)到最大值81.54%。這是由于微波強(qiáng)度的增加，萃取體系吸收較多的微波能引起萃取液的溫度升高、溶液的黏度降低、花青素的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)增加[24-25]。因此藍(lán)莓顆粒內(nèi)部的花青素更容易從細(xì)胞中擴(kuò)散出來，使得花青素萃取率增加。當(dāng)微波強(qiáng)度為150～250 W/g時(shí)，隨微波強(qiáng)度的進(jìn)一步增加，花青素的萃取率顯著降低（P＜0.05）。這是由于微波強(qiáng)度的增加使萃取液溫度持續(xù)升高，而花青素屬于熱敏性成分，其結(jié)構(gòu)通常與葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等之間的糖苷鍵形成的花色苷而存在[26-27]。一方面高溫引起氫原子開始活動(dòng)并從花青素結(jié)構(gòu)中的A環(huán)、B環(huán)和C環(huán)中脫離，破壞花青素結(jié)構(gòu)引起含量降低[28]。另一方面由于萃取過程屬于吸熱熵增加過程[29]，微波輻射產(chǎn)生的高溫驅(qū)動(dòng)反應(yīng)從黃烊鹽陽離子向甲醇假堿方向進(jìn)行，同時(shí)高溫能驅(qū)動(dòng)O2和H2O產(chǎn)生H2O2，它可以直接親核攻擊甲醇假堿C2基，從而打開花青素的C環(huán)，使其變成淡黃色不穩(wěn)定的查爾酮[30]，查爾酮進(jìn)一步分解成無色酯、苯甲酸和2,4,6-三羥基苯乙酸乙醛，從而使花青素萃取率降低[31]。因此選用微波強(qiáng)度100、150、200 W/g三個(gè)水平進(jìn)行RSM試驗(yàn)。

由圖4B可知，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)莓中花青素萃取率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，萃取時(shí)間50 s時(shí)，花青素萃取率達(dá)到最大值（81.65%）。當(dāng)萃取時(shí)間在0～50 s內(nèi)，花青素萃取率隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加（P＜0.05）。這是由于短時(shí)微波輻射造成藍(lán)莓細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞[32]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)花青素大量溶出，花青素萃取率顯著增加[33]。隨萃取時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，花青素萃取率呈現(xiàn)顯著降低趨勢(shì)（P＜0.05）。這是由于隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，熱積累效應(yīng)增強(qiáng)，萃取液溫度顯著升高。由阿倫尼烏斯方程可知，萃取液溫度與花青素的降解量成正比，溫度越高，花青素的降解量越大，故萃取后期花青素萃取率降低[34]。因此萃取時(shí)間選擇25、50、75 s三個(gè)水平進(jìn)行RSM試驗(yàn)。

由圖4C可知，花青素萃取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先顯著增加后顯著減小的趨勢(shì)（P＜0.05）。乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，花青素萃取率達(dá)到最大值（81.45%）。其原因是隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，萃取液溶解能力增加，促進(jìn)花青素的溶解，花青素萃取率增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，其極性與花青素極性相似，根據(jù)相似相溶原理，此時(shí)花青素萃取率最高[35]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60%，一方面醇溶性的雜質(zhì)、色素和親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，其成分與花青素競(jìng)爭(zhēng)乙醇-水分子，使得花青素溶出量降低，進(jìn)而導(dǎo)致花青素萃取率降低[36]；另一方面，高濃度的乙醇破壞花青素-蛋白質(zhì)和花青素-纖維素之前的氫鍵和疏水鍵[37]，破壞花青素結(jié)構(gòu)。此外，由于極性差距逐漸增大，花青素溶解度降低，擴(kuò)散系數(shù)減小，故花青素萃取率降低[38]。因此乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇50%、60%、70%三個(gè)水平進(jìn)行RSM試驗(yàn)。

由圖4D可知，當(dāng)料液比為1∶10～1∶30（g/mL）時(shí)，花青素萃取率隨萃取液比例的增加呈顯著增加的趨勢(shì)（P＜0.05），料液比為1∶30（g/mL）時(shí)花青素萃取率達(dá)到最大值（81.58%）。當(dāng)料液比超過1∶30（g/mL），隨著萃取液用量的增加，花青素萃取率無顯著變化（P＞0.05）。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能時(shí)隨著萃取液用量的增加，固液接觸面積和濃度梯度增加，有利于花青素由內(nèi)向外擴(kuò)散，萃取率增加[39]。當(dāng)萃取液用量繼續(xù)增加，固液界面的濃度差增幅逐漸降低，花青素的萃取率也趨于平緩，過多使用提取液會(huì)造成后期處理難度增加和提高成本[40]。故選擇料液比為1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）三個(gè)水平進(jìn)行RSM試驗(yàn)。

2.2 RSM試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 模型建立與顯著性檢驗(yàn)

確定RSM試驗(yàn)優(yōu)化微波輔助萃取藍(lán)莓中花青素最佳工藝條件，所得的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表2。以花青素萃取率Y為響應(yīng)值，對(duì)試驗(yàn)所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到藍(lán)莓花青素萃取率對(duì)A（微波強(qiáng)度）、B（萃取時(shí)間）、C（乙醇體積分?jǐn)?shù)）和D（料液比）的回歸方程為Y＝80.94－0.45A＋2.38B＋2.26C－1.62D＋5.63AB＋4.09AC＋2.55AD＋0.60BC－0.21BD＋1.15CD－3.559A2－3.44B2－4.46C2－3.92D2。

對(duì)回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

表2 RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design with actual and predicted response values

表3 花青素萃取率回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model

由表3可知，方程一次項(xiàng)中B、C為極顯著因素，D為顯著因素，因素對(duì)藍(lán)莓花青素萃取率影響的主次順序?yàn)锽＞C＞D＞A；方程二次項(xiàng)中A2、B2、C2、D2均為極顯著因素；各交互項(xiàng)AB、AC為極顯著因素，其余均不顯著。結(jié)果表明試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，模型中多元回歸關(guān)系極顯著（P＜0.001），相關(guān)系數(shù)R2值為0.877 3、模型的變異系數(shù)為3.46、RMSE值為5.707 1，失擬項(xiàng)P值為0.205 1（P＞0.05），失擬不顯著，說明方程擬合充分，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值的真實(shí)關(guān)系，利用該回歸方程可以確定優(yōu)化藍(lán)莓花青素萃取率的最佳提取工藝條件。

2.2.2 交互作用分析

依據(jù)RSM得到的回歸方程，建立花青素萃取率與試驗(yàn)因素的三維空間曲面圖，確定最大花青素萃取率提取條件，如圖5所示。

圖5 各試驗(yàn)因素對(duì)花青素萃取率的交互影響Fig. 5 Interactive effects of factors on the yield of anthocyanins

根據(jù)表3可知，微波強(qiáng)度和萃取時(shí)間以及微波強(qiáng)度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用極顯著影響花青素的萃取率（P＜0.001），其余因素的交互作用對(duì)花青素萃取率影響均不顯著（P＞0.05）。由圖5可知，在微波強(qiáng)度125～175 W/g、萃取時(shí)間37～62 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)55%～65%、料液比1∶25～1∶35（g/mL）條件下，藍(lán)莓花青素得率較高。在一定范圍內(nèi)適當(dāng)提高微波強(qiáng)度，萃取液溫度快速升高，由克勞修斯-克拉貝龍方程可知，萃取液溫度和壓力呈正相關(guān)[41]，兩者偶合作用使得藍(lán)莓細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，造成花青素傳質(zhì)阻力降低[42]，有利于花青素?cái)U(kuò)散到萃取液中，使得花青素萃取率增加。但是當(dāng)微波強(qiáng)度超過175 W/g時(shí)，在萃取后期萃取液溫度高于50 ℃，高溫可能導(dǎo)致花青素呈對(duì)數(shù)關(guān)系降解造成了吡喃環(huán)的破裂[43]，結(jié)果使花青素萃取率顯著降低。在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，有利于花青素萃取，但當(dāng)萃取時(shí)間超過62 s時(shí)，隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，熱積累效應(yīng)明顯增強(qiáng)，引起萃取液溫度升高，可以促進(jìn)花青素在藍(lán)莓顆粒內(nèi)的擴(kuò)散速率，提高花青素在萃取液中的溶解度，但是花青素屬于熱敏性成分[44]，萃取體系內(nèi)溫度過高引起花青素的降解，又使得花青素萃取率降低[45]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在55%～60%時(shí)，適當(dāng)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，使萃取液溶解花青素濃度增強(qiáng)，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，花青素溶解度達(dá)到最大，此時(shí)花青素萃取率也達(dá)到最大值。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于65%，溶解花青素能力降低，引起花青素萃取率降低[46]。當(dāng)料液比在1∶25（g/mL）之前時(shí)，固液界面的濃度梯度較低，不利于花青素?cái)U(kuò)散和溶解，使得花青素萃取率較低；當(dāng)料液比在1∶35（g/mL）之后時(shí)，由于固液界面存在傳質(zhì)的極限，當(dāng)溶劑用量進(jìn)一步增加，固液界面濃度差基本不變，單位體積吸收微波能減少，導(dǎo)致花青素不能完全溶出，造成花青素萃取率略有下降趨勢(shì)[47]。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過Design-Expert軟件對(duì)回歸方程分析得到最佳提取條件：微波強(qiáng)度158.76 W/g、萃取時(shí)間44.85 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)61.16%、料液比1∶31.35（g/mL），花青素萃取率的理論值為85.58%，為驗(yàn)證該方法的可靠性，考慮實(shí)際情況，將最佳工藝參數(shù)修正為微波強(qiáng)度160 W/g、萃取時(shí)間45 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶30（g/mL），在此條件下進(jìn)行花青素萃取率的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并重復(fù)3 次，花青素萃取率平均值為83.32%，理論值和實(shí)驗(yàn)值相差2.26%。說明模型可以較好地模擬和預(yù)測(cè)藍(lán)莓花青素萃取率，從而也證明了采用RSM優(yōu)化花青素提取條件參數(shù)的可行性。

2.3 ANN模型構(gòu)建結(jié)果

2.3.1 ANN結(jié)構(gòu)

建立萃取工藝的ANN模型，以微波強(qiáng)度、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比作為網(wǎng)絡(luò)5 個(gè)輸入層神經(jīng)元，中間有一個(gè)隱含層，包括50 個(gè)神經(jīng)節(jié)點(diǎn)，花青素萃取率作為網(wǎng)絡(luò)輸出層的一個(gè)輸出神經(jīng)元，ANN的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為4-50-1。由圖6可知，通過10 000次學(xué)習(xí)，學(xué)習(xí)率為0.01、訓(xùn)練步長(zhǎng)為10、動(dòng)量因子為0.1，直到目標(biāo)誤差達(dá)到為0.000 1訓(xùn)練結(jié)束。顯示出訓(xùn)練樣本和測(cè)試樣本與其對(duì)應(yīng)預(yù)測(cè)值的吻合度較好，二者的相對(duì)誤差為0.000 1，說明所建立的ANN模型具有很強(qiáng)的預(yù)測(cè)性和準(zhǔn)確性。

圖6 訓(xùn)練模型適配Fig. 6 Training model adaptation

2.3.2 利用GA優(yōu)化及驗(yàn)證花青素提取工藝結(jié)果

將表2中RSM的試驗(yàn)結(jié)果作為初始群體，通過ANN模型調(diào)試函數(shù)的適應(yīng)度，以藍(lán)莓中花青素萃取率作為其函數(shù)的輸出值，將ANN建模和GA結(jié)合對(duì)萃取工藝進(jìn)行全局尋優(yōu)，獲得最佳的微波輔助萃取藍(lán)莓中花青素的工藝。

圖7 適應(yīng)度曲線Fig. 7 Fitness curve

由圖7可知，經(jīng)過30 代后達(dá)到最佳適應(yīng)度。其花青素萃取率已達(dá)到最大值，隨后基本保持不變，經(jīng)GA對(duì)萃取工藝進(jìn)行全局尋優(yōu)，獲得的藍(lán)莓花青素平均萃取率預(yù)測(cè)最大值為86.33%，其對(duì)應(yīng)的提取工藝參數(shù)為微波強(qiáng)度155.36 W/g、萃取時(shí)間52.65 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)55.71%、料液比1∶30.38（g/mL）?？紤]實(shí)際操作，將工藝參數(shù)進(jìn)行修改為微波強(qiáng)度155 W/g、萃取時(shí)間53 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、料液比1∶30（g/mL）。在此工藝條件下，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，花青素萃取率平均值為85.12%，預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值相差1.21%，并且高于RSM得到花青素萃取率83.32%。

2.3.3 RSM和GA-ANN預(yù)測(cè)結(jié)果的對(duì)比

RSM和GA-ANN模型所提供的花青素萃取率預(yù)測(cè)值見表2。依據(jù)方程（6）、（7）計(jì)算得出RSM和GA-ANN的RMSE、AAD、R2的值分別為5.707 1、2.276 3%、0.877 3和4.778 1、2.005 0%、0.904 4。RSM和GA-ANN模型對(duì)花青素萃取率預(yù)測(cè)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估結(jié)果如圖8所示。從圖8和RMSE、AAD、R2數(shù)值大小可知，GA-ANN模型比RSM模型具有更高擬合度、更高精度和估計(jì)預(yù)測(cè)能力[9]。

圖8 對(duì)比花青素萃取率的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值Fig. 8 Comparison between the experimental and predicted values of anthocyanins yield

2.3.4 對(duì)比RSM優(yōu)化和GA-ANN優(yōu)化結(jié)果

表4 優(yōu)化結(jié)果比較Table 4 Comparison of optimization results

由表4可知，GA-ANN模型的相對(duì)誤差明顯低于RSM優(yōu)化的相對(duì)誤差，這表明GA-ANN優(yōu)化結(jié)果高于RSM優(yōu)化方法，優(yōu)化的結(jié)果更加可信，證明用該方法進(jìn)行優(yōu)化微波萃取藍(lán)莓中的花青素是可行的。這與Cheok[9]和Lin Jun’an[48]等研究結(jié)果相似。

3 結(jié) 論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理進(jìn)行RSM試驗(yàn)。通過分析單因素的萃取特性發(fā)現(xiàn)，花青素萃取率隨每個(gè)因素水平的增加均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。隨后采用RSM優(yōu)化和GA-ANN模型法對(duì)微波輔助萃取藍(lán)莓中花青素的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)比兩者的優(yōu)化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RSM的RMSE、AAD值明顯高于GA-ANN模型，而R2值低于GA-ANN模型，這表明GA-ANN模型的預(yù)測(cè)和評(píng)估能力優(yōu)于RSM。最終采用GAANN優(yōu)化得到微波萃取藍(lán)莓中花青素的最佳工藝條件：微波強(qiáng)度155 W/g、萃取時(shí)間53 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)56%、料液比1∶30（g/mL）。在此條件下，花青素萃取率為85.12%。本研究為全面探究工藝參數(shù)對(duì)結(jié)果的影響提供了一種有效方法。