山牽牛炭疽病病原分離與鑒定△

宋利沙，蔣妮*

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023)

山牽牛Thunbergiagrandiflora(Rottl.ex Willd.)Roxb.，別名大花山牽牛、大花老鴨嘴、大青和老鴨杓，是爵床科Acnthaceae山牽牛屬藤本植物[1]。山牽牛在廣西、廣東、海南和福建鼓浪嶼均有種植。山牽牛是瑤醫(yī)藥用植物之一，主要用于消腫拔毒，排膿生肌，止痛。根皮用于跌打損傷和骨折。莖葉蛇咬傷，瘡癤，葉用于治療胃痛[2-3]。目前，對山牽牛主要做為觀賞藤本植物[4]，對其藥理活性和病害研究尚未見報(bào)道。作者在廣西藥用2017年在廣西南寧市廣西藥用植物園瑤藥區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)一種嚴(yán)重影響山牽牛生長的病害，該病害主要為害山牽牛葉片，嚴(yán)重時(shí)造成葉片枯死。鏡檢發(fā)病組織上的病原孢子，初步將病原菌判斷為炭疽菌屬Colletotrichumsp.真菌，為進(jìn)一步明確該病原菌的分類地位，本研究對病原菌進(jìn)行了分離，并通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行鑒定，為該病害的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山牽牛病株于2017年3月采自廣西壯族自治區(qū)南寧市興寧區(qū)廣西藥用植物園瑤藥區(qū)。

1.2 病原菌分離和純化

選取山牽牛葉片的病健交界處病組織，切成 5 mm×5 mm小塊，用75%乙醇浸泡30S，0.1%升汞消毒l min，再用無菌水漂洗 3次，置于PDA培養(yǎng)基上 28 ℃培養(yǎng)，待長出菌絲后，挑取菌落邊緣進(jìn)行純化，純化后的菌落通過單孢分離獲得純培養(yǎng)分離物[5]。

1.3 病原菌的致病性測定

用針刺法將分離和純化的菌絲塊(1 cm×1 cm)接種于無病健康且長勢相近的山牽牛葉部[5]，以接種無菌PDA培養(yǎng)基(1 cm×1 cm)作為對照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，放置于具有濕潤的濾紙片的培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)，定期觀察發(fā)病情況。適時(shí)對發(fā)病組織進(jìn)行病原菌分離和純化，觀察該病原菌是否與接種菌株相同。

1.4 病原菌形態(tài)鑒定

觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落特征，用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲、分生孢子等形態(tài)特征，對病原菌進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

將純化好的拮抗菌株移植于PDA平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d，然后接種到40 mL PDA培養(yǎng)液的三角瓶(100 mL)中，于28 ℃、180 r·min-1，恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后制成菌體懸浮液，離心收集菌體，采用改良的SDS裂解法用DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取真菌基因組DNA。ITS擴(kuò)增引物序列為通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′)。擴(kuò)增反應(yīng)在25 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行，Template(基因組DNA 20～50 ng·μL-1)為0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)為2.5 μL，dNTP(各2.5 mM)為1 μL，酶0.2 μL，引物各0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。熱循環(huán)反應(yīng)程序設(shè)置如下：94 ℃下初始變性4 min，接下來為94 ℃下變性45 sec，55 ℃下引物退火45 sec，72 ℃下延伸 60 sec，30個(gè)循環(huán)結(jié)束后在72 ℃下修復(fù)延伸10 min。擴(kuò)增中利用水代替DNA模板為空白對照。用凝膠電泳法檢測PCR反應(yīng)結(jié)果，吸取4 μL PCR產(chǎn)物加入1%(W/V)瓊脂糖凝膠，凝膠置于1×TBE緩沖液(0.9 M Tris-Borate，0.01 M EDTA，pH=8.3)中，在110 V下電泳40 min。將擴(kuò)增后的 DNA 產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化測序。并且把測序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行blast比對。以ITS相似序列，利用MEGA4.0軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果分析

2.1 病害癥狀

該病主要危害山牽牛葉片。葉片發(fā)病后，病斑在葉尖、葉緣、葉中部近圓形或不規(guī)則形狀發(fā)展。病斑發(fā)病初期，出現(xiàn)黑色小斑點(diǎn)，隨后擴(kuò)大成多邊形黑褐色病斑，病斑周圍有黃色暈圈，后期病斑穿孔，病斑較多時(shí)融合成片，病葉后期葉片黃化枯死(圖1)。該病害在山牽牛生長期均可發(fā)生，且種種植密度大、排水不良的地塊發(fā)病較重；高溫氣候，多雨季節(jié)，發(fā)生嚴(yán)重，蔓延迅速。

圖1 山牽牛葉部危害癥狀

2.2 病原菌分離和致病性測定

對山牽牛葉片病斑進(jìn)行病原分離，分離純化得到形態(tài)特征不同的真菌菌株4株。用針刺法將這些菌株接種在離體健康山牽牛葉片上，只有sb10菌落致病。接種后5 d葉片開始發(fā)病，7 d后接種部位變黑褐色病斑，病斑周圍暗黃褐色。對照葉片組織未發(fā)病。從發(fā)病的病斑上再次分離到與接種菌株形態(tài)一致的病原菌。

圖2 山牽牛炭疽病離體接種癥狀

2.3 病原菌的形態(tài)鑒定

病原菌sb10在PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)5～7 d，菌落圓形，邊緣整齊，菌落從中央變?yōu)樯罨液谏浔趁媸巧罨疑妮喖y，培養(yǎng)6 d后，菌落中央產(chǎn)生紅色球形的分生孢子團(tuán)。該病菌的菌絲有隔，粗度為2～4 μm，分生孢子盤圓形或橢圓形，黑褐色，直徑112～248 μm；剛毛散生于分生孢子盤上，深褐色；分生孢子單胞，無色，長橢圓形，兩頭鈍圓或一端稍尖，大小(11～21)μm×(4～6)μm。

參照《真菌鑒定手冊》[7]和《植物病原真菌學(xué)》[8]，將該病原菌鑒定為半知菌類腔孢綱黑盤孢目炭疽菌屬膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。

注：a.菌落；b.分生孢子盤；c.分生孢子。圖3 山牽牛炭疽病病原形態(tài)

2.4 病原菌的分子(ITS)鑒定

利用真菌 ITS 通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對病原真菌的 rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，獲得片段大小約為 563 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物在 GenBank 中進(jìn)行 BLAST比對，結(jié)果顯示，與山牽牛病病原菌的 ITS 序列相似度在 99% 以上的菌株為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides，并與其相似高的菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，綜合菌株sb10形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定該病原菌為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。

圖4 基于ITS序列構(gòu)建sb10菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)論和討論

山牽?？勺髦兴幉氖褂?，也可作為觀賞的藤本植物，其栽培和開發(fā)利用有很大的廣闊前景。作者在廣西藥用植物園種植區(qū)發(fā)現(xiàn)較嚴(yán)重的炭疽病，并利用形態(tài)學(xué)和分子手段將該病原鑒定為膠孢炭疽菌C.gloeosporioides。該炭疽菌可危害地榆、田七、貓豆、闊葉十大功勞等多種植物[9-12]，是世界上分布最廣的病原菌，但此病原危害山牽牛的葉片為國內(nèi)第一次報(bào)道。此外，膠孢炭疽菌在致病性、寄主特異性和遺傳同質(zhì)性等方面可形成許多亞組和形態(tài)種[9]。本研究所獲得菌株的寄主范圍和?；痛_定有待進(jìn)一步研究確定。該病原菌的生物特性、侵染循環(huán)、發(fā)病條件、防治技術(shù)、藥理活性等需要進(jìn)一步研究加以明確。

目前，山牽牛炭疽病可參考由膠孢炭疽菌引起的其他作物炭疽病的防治技術(shù)進(jìn)行控制，如選用無病種子或進(jìn)行種子消毒、及時(shí)清除病殘?bào)w、合理密植、創(chuàng)造良好的通風(fēng)透光條件、合理施肥用水等，或在發(fā)病初期使用25%咪鮮胺乳1500倍液噴霧。具體藥劑種類及綜合防治技術(shù)尚待室內(nèi)篩選試驗(yàn)和田間實(shí)踐驗(yàn)證。