周 曼，鄧良偉，楊紅男，劉 刈，蒲小東，陳子愛，李和平，李揚眉

（1.農業(yè)部沼氣科學研究所，成都 610041；2.四川農業(yè)大學水利水電學院，四川 雅安 625014）

沼氣發(fā)酵技術是處理畜禽糞污的重要手段，在消納有機廢棄物、保護環(huán)境的同時，能生產可再生能源甲烷和有機肥，因此受到越來越廣泛的關注[1-2]。

溫度是影響厭氧微生物及沼氣發(fā)酵過程的關鍵因素。通常溫度越高，微生物活性越高，相應地，沼氣發(fā)酵分為常溫（15～25℃）、中溫（35～37℃）、高溫（50～60℃）三個溫度范圍。迄今為止，大多數(shù)沼氣發(fā)酵系統(tǒng)在中溫范圍運行。在厭氧微生物生長范圍內，一般溫度每升高10℃，沼氣發(fā)酵反應速度增加約一倍。當溫度低于最優(yōu)溫度，每下降1℃，沼氣發(fā)酵速率下降11%[3]，如果發(fā)酵液溫度突然變化超過3℃，污泥的活性會顯著降低[6]。具體到每種發(fā)酵原料，受溫度影響也不相同。例如，在10、15、20、25、30 ℃和35℃溫度下豬場廢水沼氣發(fā)酵最大容積產氣率分別是0.071、0.271、1.173、1.948、2.196 L·L-1·d-1和 2.871 L·L-1·d-1[4]?？捎脺囟然钚韵禂?shù)（θ值）定量反映溫度對沼氣發(fā)酵的影響，在15～20℃范圍θ值最高為1.332，20～25、25～30℃和30～35℃分別為1.043、1.041 和 1.028[5]。

脫氫酶和輔酶F420是產甲烷菌代謝途徑兩種重要輔酶，其在微生物體內或者污泥樣品內含量可以用來衡量活性微生物量的大小以及該污泥樣品對某種有機物的降解活性。在乙酸、丙酸、乳酸和丁酸對沼氣發(fā)酵過程的脅迫作用中，脫氫酶的活性可反應活性污泥的活性變化[7]。從不同的膜載體對牛糞厭氧發(fā)酵的影響可看出，輔酶F420在某種程度上可以作為產甲烷菌數(shù)量變化的參考[8]，輔酶F420的相對濃度與甲烷產生速率呈線性相關，這進一步表明輔酶F420可以表示特定生物反應器的產甲烷活性[9]。

相對于濕式沼氣發(fā)酵，干式發(fā)酵具有沼渣沼液濃度高、數(shù)量少、容易利用等優(yōu)點[10-11]。但是，干發(fā)酵過程傳質困難，隨總固體（TS）濃度增加，傳質能力急劇降低，TS濃度為8%和25%發(fā)酵液的有效擴散系數(shù)數(shù)值分別僅為水的參考值的1/50和1/185[12]。各種中間代謝產物和微生物的交流受到嚴重限制，加劇氨抑制和脂肪酸積累，從而進一步使微生物活性受到抑制。豬糞濕式和干式沼氣發(fā)酵都可以順利啟動并良好運行[13-14]，但雞糞比牛糞、餐廚廢棄物、豬糞和活性污泥都有更高的氮含量[15]，一般采用濕式沼氣發(fā)酵，進料TS為8.93%，早期總氨氮（TAN）濃度低于5000 mg·L-1，原 料 沼 氣 產 氣 率 為 0.35～0.4 L·g-1VSadded，但隨發(fā)酵進行，TAN濃度增加，沼氣產量降低[16]，因為隨溫度增加，游離氨濃度增加，導致氨氮抑制加重，使得沼氣產量減少。雞糞干式沼氣發(fā)酵很多嘗試都最終失敗[17]。鑒于此，本文研究了雞糞中溫沼氣干發(fā)酵的啟動，并考察了啟動階段溫度變化對產氣性能的影響，通過分析發(fā)酵過程中產氣率、總氨氮、揮發(fā)性脂肪酸、脫氫酶活性和輔酶F420濃度變化反映污泥活性，以期為雞糞沼氣發(fā)酵工程的啟動提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雞糞取自四川省雅安市某規(guī)模蛋雞場，取回當日新鮮雞糞置于4℃冰箱冷藏備用。接種污泥取自四川省某規(guī)模豬場正常運行的廢水處理沼氣工程，取回后35℃水浴培養(yǎng)至無殘余產氣備用。底物和接種污泥理化指標見表1。

1.2 試驗裝置

干式沼氣發(fā)酵試驗裝置為具有三通出口的玻璃瓶，總容積2500 mL（有效容積1600 mL），用帶有進料管、出料管和排氣管的橡皮塞密封（圖1）。集氣瓶為總容積為2500 mL玻璃瓶，用帶有進氣管和排水管的橡皮塞密封，沼氣發(fā)酵瓶和集氣瓶通過橡皮管連接。測量集氣瓶排出水的容積，即為沼氣產量。

1.3 試驗設計

試驗采用污泥全接種，即將1600 mL厭氧污泥裝入沼氣發(fā)酵瓶。反應器設計容積負荷為1.1 g TS·L-1·d-1，進料TS濃度為22.09%，水力停留時間為160 d。即每日進料10 mL，進料之前先排出發(fā)酵殘余物10 mL。共5組反應器，每組2個重復。

初始5組反應器均設置在35℃水浴連續(xù)培養(yǎng)，待出料pH、出料COD、日產氣量穩(wěn)定后，將其中4組反應器分別轉移至15、20、25℃和30℃條件下進行水浴培養(yǎng)，待降溫處理一段時間后，再次將4個降溫處理組反應器升溫恢復至35℃培養(yǎng)條件。35℃溫度處理組反應器為對照，始終保持發(fā)酵溫度不變。整個試驗過程中每日測沼氣產量和甲烷含量，每隔2 d測TAN、VFAs、脫氫酶活性和輔酶F420濃度。試驗開始前測定接種污泥化學成分為C11.91H5.02O1.69NS0.18，雞糞化學成分為C16.05H29.35O3.06NS0.06。

表1 底物和污泥的基本性質Table 1 Characteristics of substrates and inoculum sludge

圖1 沼氣發(fā)酵裝置示意圖Figure 1 Diagrammatic sketch of anaerobic reactor

1.4 分析方法

TS、VS測定采用重量法；pH值測定采用pHS-3C+酸度計；TAN測定采用納氏試劑分光光度法（HJ 535—2009）；TKN測定采用硫酸-過氧化氫消解-凱氏定氮法；VFAs成分測定采用氣相色譜儀Aglient 7820A GC火焰監(jiān)測器（Agilent Technologies，USA）；沼氣成分測定采用沼氣成分分析儀（BIOGAS 5000，Geotech，UK）；元素分析測定采用元素分析儀（CE In?struments，Milano，Italy）；脫氫酶活性測定以 2-3-5-triphenyltetrazolium chloride（TTC）為底物，經脫氫酶催化還原反應后生成紅色產物TTCH2-trifenylforma?zane（TF），顏色的深淺反映脫氫酶活性的高低[18]；輔酶F420測定采用紫外分光光度法[19]。FA由公式（1）計算[20]：

式中：[NH3]為游離氨含量，mg·L-1；[TAN]為總氨態(tài)氮含量，mg·L-1；T 為發(fā)酵料液的溫度，K。

2 結果與討論

2.1 溫度變化對發(fā)酵運行的影響

在厭氧生態(tài)系統(tǒng)中，產甲烷菌對溫度波動比較敏感，發(fā)酵液溫度改變會導致污泥活性發(fā)生改變，產氣也隨之變化。如圖2所示，5組厭氧反應器首先同時于35℃溫度下啟動運行，使用水浴鍋維持發(fā)酵溫度，每日進出料，進料TS濃度為22.09%，進料負荷為1.1 g TS·L-1·d-1，容積產氣率逐漸穩(wěn)定在0.459～0.510 L·L-1·d-1之間。運行至第6 d后，溫度突然下降至30、25、20℃和15℃時，相比35℃溫度處理組，30、25℃和20℃溫度處理組的容積產氣率分別降低27.2%、73.4%和95.3%，隨后產氣量逐漸小幅上升。15℃溫度處理組發(fā)生產氣停滯現(xiàn)象，超過10 d才恢復產氣。各溫度處理組在各自溫度條件下運行12 d，第18 d溫度驟升恢復至35℃，15℃溫度處理組產氣量發(fā)生短暫停滯，20、25℃和30℃溫度處理組產氣量發(fā)生小幅降低，之后皆出現(xiàn)產氣上升的現(xiàn)象，25℃和30℃最早恢復到與35℃對照組產氣相當?shù)臓顟B(tài)，15℃和20℃產氣量逐漸提升，最終在近10 d時也基本恢復到與35℃對照組相當?shù)漠a氣量。15℃和20℃產氣恢復較慢原因主要是由于低溫運行時快速積累了較高的VFAs（圖3）。整個發(fā)酵過程中，對總VFAs構成中乙酸、丙酸和丁酸含量分析發(fā)現(xiàn)，乙酸始終占總VFAs中絕對比例，對總酸大量積累有最大貢獻。脂肪酸大于4000 mg·L-1時發(fā)酵過程發(fā)生抑制[21]，在恢復到35℃時，15℃和20℃溫度處理組VFAs濃度分別達到5829 mg·L-1和7465 mg·L-1，遠超過了抑制閾值，因此需經歷更長時間降解積累中間產物，故導致產氣率降低，隨VFAs濃度降低，產氣逐漸得以恢復。變溫處理期間，各溫度處理組TAN濃度在2700～3200 mg·L-1之間（圖4），35℃溫度處理組FA濃度最高為170 mg·L-1。FA 的 抑 制 閾 值 為 1100 mg·L-1（對 應 TAN 為3400 mg·L-1），低于此濃度，比增長速率基本保持不變[21]。此過程TAN濃度在抑制閾值之下，F(xiàn)A濃度遠低于抑制閾值。

圖2 容積產氣率和甲烷產率的變化Figure 2 Variations of methane yield and volumetric biogas production rate

圖3 總揮發(fā)酸濃度變化Figure 3 Variations of total volatile acid

試驗結果說明在雞糞干發(fā)酵啟動階段，因為運行時間不長，TAN尚未達到抑制產氣濃度，產氣效果主要受溫度影響。甲烷微生物對溫度變化非常敏感，尤其突然降低溫度使沼氣發(fā)酵微生物活性受限，微生物的生長和代謝隨之降低，繼而導致中間代謝產物如VFAs積累，產氣能力降低。因此，為了保持厭氧反應器高效穩(wěn)定的產氣性能，保持適宜、穩(wěn)定的溫度尤為重要。試驗中較大幅度的溫度變化，并沒有對反應器造成持續(xù)惡劣的影響，重新恢復到35℃時，經歷一定時間，各溫度變化組最終產氣量均恢復到與35℃產氣量相當水平。這說明沼氣發(fā)酵微生物對一定溫度變化范圍波動具有一定的適應性，足夠的時間范圍內可以順利恢復。

2.2 溫度變化對沼氣產量和甲烷含量的影響

沼氣產量和甲烷含量是評價沼氣工程發(fā)酵效果的重要指標，而原料的化學成分決定了潛在沼氣產量和氣體成分。已知原料的化學成分可以評估理論甲烷產量。

本研究底物雞糞的化學成分為C16.05H29.35O3.06NS0.06，在標準溫度和氣壓下（STP，0℃、760 mmHg），由公式（2），可計算得到理論原料沼氣產率和原料甲烷產率，分別為1.42 L Biogas·g-1VS和0.85 L CH4·g-1VS，理論甲烷含量60.0%。如圖2所示第（Ⅱ）階段，溫度驟降，不同溫度處理組產氣性能受到不同程度影響。15、20、25、30℃和35℃溫度處理組最大原料甲烷產率分別為0.011、0.074、0.211、0.261 L CH4·g-1VS和0.294 L CH4·g-1VS。35℃溫度處理組產氣率最高，但也僅為理論值的35%。實際值較理論值偏低，主要原因是底物降解不完全。一方面底物中含有一部分難降解有機物，這部分有機物未降解。另一方面，底物可利用有機物轉化不完全，未轉化或未轉化為沼氣底物排出反應器。

圖4 氨氮和游離氨濃度變化Figure 4 Variations of TAN and FA

容積產氣率是沼氣工程設計和投資核算的基礎參數(shù)。變溫處理期間，15、20、25、30℃和35℃溫度處理組最大容積沼氣產氣率分別為0.017、0.126、0.357、0.442 L·L-1·d-1和0.493 L·L-1·d-1。35 ℃溫度處理組最大容積沼氣產氣率最高。容積產氣率不隨溫度而線性增加可能是由微生物對底物的飽和程度決定的[5]。

由公式（3）計算可得，忽略水蒸汽氣壓的影響，不同溫度下不同干燥氣體理論產率和實際產率差異不大。變溫處理過程中，沼氣成分發(fā)生變化，隨溫度增加，甲烷含量增加。35、30、25、20℃和15℃溫度處理組的平均甲烷含量分別為60%、59%、57%、53%和50%。15℃和20℃的甲烷含量要明顯低于25～35℃，說明低溫條件VFAs積累，造成酸化，酸化細菌活性相對較高，產甲烷細菌活性降低，產甲烷階段比產酸階段受到更大影響，產甲烷菌對低溫更敏感。

變溫過程中，不同溫度條件下產氣性能的差異可能是由于微生物群落結構和活性隨溫度梯度的變化而急劇變化，相應的導致了消化性能的變化，即甲烷產量、VFAs濃度等發(fā)生變化。對于溫度變化造成的影響并未見較多報道，有學者研究了豬糞濕發(fā)酵反應器從35℃降低至30℃，并再次恢復到32℃兩個溫度脈沖過程，原料甲烷產率均有所降低，但較快恢復到和35℃相當?shù)漠a氣率，結果并未造成較大的影響[22]。Lin等[23]研究了在不同溫度下微生物基因表達和沼氣生產的關系，每日甲烷產量和總產氣量隨溫度（25、35、45℃和50℃）升高而增加。微生物調節(jié)的溫度影響厭氧消化系統(tǒng)性能，其運行機制還不甚清楚。一種可能是由于通過增加微生物群落的α多樣性和提供更多功能途徑的潛在相關活動和代謝網絡的活動，并增加微生物群落整個活動，尤其是產甲烷活動，從而提高厭氧消化過程的力量和效率[23]。另一種可能通過減少功能性途徑的多樣性（α多樣性相反），但提高中心功能的途徑，使大部分細胞的活動和資源投資于甲烷及相關途徑，提高轉換效率[24]。本試驗變溫處理時間短，主要考察由于溫度變化造成的影響，各溫度處理組也可能尚未達到各自溫度條件下的穩(wěn)定運行狀態(tài)，對于不同溫度條件對厭氧干發(fā)酵產氣性能的長期影響需要更多試驗研究。

2.3 酶活對產氣特性的反應

脫氫酶作為一種胞內酶與細胞內的氧化磷酸化過程緊密相關，是反映沼氣發(fā)酵體系中微生物活性的一個重要指標[25-26]。由圖5a可以看出，與35℃時相比，溫度驟降為15、20、25℃和30℃的酶活分別降低了65.52%、50.63%、42.53%和36.78%。各溫度處理組在穩(wěn)定運行時，隨溫度降低，脫氫酶也呈現(xiàn)較低的活性，第12 d，15、20、25、30℃和35℃的酶活性分別為 45.36、79.2、158.4、365.2 TF μg·mL-1·h-1和 383.2 TF μg·mL-1·h-1。運行至第18 d，溫度再次升高，酶活力逐漸上升，試驗運行至第30 d到第40 d，各溫度處理組間酶活性差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。

在厭氧消化產甲烷的代謝途徑中有兩類重要的輔酶，一是作為甲基載體的輔酶，二是作為電子載體的輔酶。輔酶F420屬于后者，是產甲烷菌特有的輔酶，其濃度可以反映厭氧顆粒污泥產甲烷的活性[9]。由圖5b可以看出，與35℃時相比，溫度驟降為15、20、25℃和30℃時F420酶活分別降低了89.10%、79.15%、71.56%和29.86%。隨溫度降低，各溫度處理組輔酶F420也呈現(xiàn)較低的活性，第 12 d，15、20、25、30 ℃和35 ℃的酶活性分別為0.16、0.34、1.11、1.77 μmol·L-1和 1.89 μmol·L-1。運行至第 18 d，溫度再次升高，酶活力逐漸上升，試驗運行至第30 d到第40 d，對各溫度處理組間酶活性差異不顯著（P＞0.05）（圖6）。

圖5 脫氫酶活性和輔酶F420濃度變化Figure 5 Variations of dehydrogenase activity and F420concentrations

圖6 脫氫酶和輔酶F420與甲烷產率的線性相關性Figure 6 The linear correlation of dehydrogenase activity and F420concentrations with methane yield

也有研究表明輔酶F420作為厭氧活性污泥指標可能是不可行的[19]，即在同種污泥的不同時期，輔酶F420的含量與最大甲烷產率之間存在著一定的正相關，但不為線性相關。在本試驗中輔酶F420相對濃度與甲烷產率呈現(xiàn)一定的線性相關性的原因一種可能是由于同種污泥的不同運行時期，產甲烷菌的種類及其各自所占的比例不同，而導致不同的甲烷菌中輔酶F420的含量不同；另一種可能是輔酶F420作為產甲烷菌所特有的輔酶[27]，其活性變化與蛋白質含量呈線性相關[19]，且一般認為輔酶F420是由嗜氫產甲烷菌分泌的[28]。雞糞中未降解蛋白質含量較高，其沼氣發(fā)酵過程中以耐受氨氮的嗜氫甲烷菌為主導[16]，故而呈現(xiàn)更為敏感的變化。

3 結論

（1）采用污泥全接種方式，35℃雞糞中溫干式沼氣發(fā)酵可以順利啟動，揮發(fā)酸沒有達到抑制濃度，氨氮也尚未達到抑制水平，溫度是影響產氣性能的主要因素。

（2）沼氣發(fā)酵微生物對溫度變化敏感。雞糞中溫干式沼氣發(fā)酵啟動過程中，溫度變化會導致產氣量降低，較低溫度條件下VFAs快速大量積累，對產氣影響較大。沼氣發(fā)酵微生物對一定范圍的溫度變化具有一定的適應性，足夠的時間內可以順利恢復，但溫度變化導致厭氧干發(fā)酵啟動時間延長。

（3）相比脫氫酶，輔酶F420的活性變化與甲烷產率變化趨勢更相似，有更好的線性擬合關系，能反映雞糞中溫干式沼氣發(fā)酵啟動過程中產氣性能的變化，可作為厭氧干發(fā)酵啟動階段或進行變溫管理中監(jiān)測污泥活性的指標。