楊 揚(yáng) 孟 潔# 溫 濤 陳 博 劉 飛 顧 寧 許海燕# 于 薇 劉 健#*

1(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005) 2(東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210096) 3(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，南京 210018) 4(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，北京 100029)

引言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，是全球范圍內(nèi)引起女性死亡的第二大因素[1]，僅排在肺癌之后。而國家癌癥中心發(fā)布的《2017年中國腫瘤的現(xiàn)狀和趨勢》報(bào)告顯示，中國乳腺癌發(fā)病率位列女性惡性腫瘤之首。開發(fā)特異性靶向分子影像探針，實(shí)現(xiàn)對原發(fā)性和繼發(fā)性乳腺癌病灶的早期診斷，對于克服目前乳腺癌臨床治療所面臨的侵襲轉(zhuǎn)移及高復(fù)發(fā)率難題[2]，提高患者的遠(yuǎn)期生存率具有重要的意義。

目前，針對分子影像學(xué)探針的研究主要集中在放射性核素成像、熒光成像及磁共振成像上[3-6]。一方面，基于放射性同位素標(biāo)記的單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像(single-photon emission computed tomography，SPECT)或正電子發(fā)射斷層成像(positron emission tomography，PET)等技術(shù)盡管具有較高的靈敏度，但空間分辨率低，而且放射性探針帶來的輻射性損傷、高成本及使用上的不便限制了其大范圍推廣應(yīng)用[7]；另一方面，基于光學(xué)成像技術(shù)的近紅外熒光反射(near-infrared fluorescence reflectance，NIFR)或熒光分子斷層掃描(fluorescence molecular tomography，F(xiàn)MT)等技術(shù)雖然具有較高的靈敏度和時(shí)間分辨率，但在組織穿透方面具有天生的缺陷[8]。相對而言，磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)技術(shù)是一種安全、非侵入性的診斷方法，其空間分辨率高，沒有電離輻射危險(xiǎn)，還可以三維顯示組織解剖細(xì)節(jié)，已廣泛應(yīng)用于腫瘤的成像中[9-11]。而超順磁性氧化鐵納米顆粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPIO)具有超順磁性及良好的生物相容性，是一種有效的MRI對比劑[12]。特別是SPIO具有較大的比表面積，可通過化學(xué)偶聯(lián)等手段導(dǎo)入不同的靶向配體，有助于實(shí)現(xiàn)疾病的靶向診斷，并提高微小病灶的檢出率[13-14]。

尿激酶受體(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)屬于Ly-6超家族，是一類高度糖基化的膜錨定蛋白[15]，在大多數(shù)腫瘤如乳腺癌、前列腺癌等的生長、侵襲、血管生成過程中扮演著重要的角色[16-19]。不同于一般的腫瘤特異性抗原，uPAR不僅在腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，在腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)上，其表達(dá)量也顯著高于正常組織[20]。因此，以uPAR為靶點(diǎn)的分子影像學(xué)探針對于腫瘤的早期診斷具有重大的價(jià)值。

在本研究中，我們將uPAR的天然配體尿激酶(urokinase-type plasminogen activator，uPA)的氨基末端片段(amino-terminal fragment，ATF)偶聯(lián)到SPIO上，制備了一種uPAR靶向的MRI探針(SPIO-ATF)，對其物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了分析，并利用小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1對其腫瘤靶向性進(jìn)行了評價(jià)，期望其能夠提高乳腺癌早期影像學(xué)診斷的檢出率。

1 材料和方法

1.1 材料與細(xì)胞

SPIO水溶液(鐵濃度：24 mg/mL，顆粒核心為γ-Fe2O3，外層包被羧甲基化葡聚糖)由南京正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司制備。帶有組氨酸標(biāo)簽(histidine tags，His tags)的小鼠來源ATF購自上海生工生物工程股份有限公司，純度大于95%，濃度為2.16 mg/mL，分子量約為17 kDa，氨基酸序列為：MSVLGAPDESNCGCQNGGVCVSYKYFSRIRRCSCP RKFQGEHCEIDASKTCYHGNGDSYRGKANTDTKG RPCLAWNAPAVLQKPYNAHRPDAISLGLGKHNYC RNPDNQKRPWCYVQIGLRQFVQECMVHDCSLSKLE HHHHHH。實(shí)驗(yàn)中所用其他化學(xué)試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司。

小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，并在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素與100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)箱溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。

1.2 SPIO-NTA的制備

取0.5 mL SPIO水溶液與4.5 mL活化緩沖液(0.05 M 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acid，MES)，0.5 M NaCl，pH 6.0)混合，將2.1 mg 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide，EDC)與6 mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺(sulfo-N-hydroxysuccinimide，sulfo-NHS)溶解在0.5 mL活化緩沖液中。將上述兩種溶液混合后在室溫下磁力攪拌15 min，以活化SPIO表面的羧基，然后加入7.708 μL 2-巰基乙醇，室溫下反應(yīng)10 min以終止活化反應(yīng)。

將75.3 mg氨基化次氮基三乙酸(amino-nitrilotriacetic acid，A-NTA)用5 mL磷酸鈉緩沖液(0.1 M，pH 7.5)溶解后加入上述反應(yīng)液中，室溫條件下持續(xù)攪拌2 h，使SPIO表面活化的羧基與A-NTA的氨基進(jìn)行反應(yīng)，從而將A-NTA偶聯(lián)到SPIO上。將反應(yīng)液在50 000 r/min條件下超速離心2 h，收集沉淀，得到SPIO-NTA。

用10 mL雙蒸水重懸SPIO-NTA，再加入68.2 mg NiCl2·6H2O，室溫下磁力攪拌30 min，使Ni2+通過4個(gè)配位鍵與NTA相結(jié)合。反應(yīng)液經(jīng)過50 000 r/min超速離心2 h后，棄去上清，并用雙蒸水洗滌2遍，以除去未反應(yīng)的Ni2+。用5 mL雙蒸水重懸終產(chǎn)物SPIO-NTA-Ni2+并保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SPIO-ATF的制備

取300 μL SPIO-NTA-Ni2+溶液，將其緩慢滴加到1 mL ATF溶液中，4 ℃振蕩孵育2 h后放于4 ℃過夜，使ATF通過His tags與Ni2+形成2個(gè)配位鍵，從而偶聯(lián)到SPIO上。反應(yīng)液經(jīng)過50 000 r/min超速離心1 h，收集沉淀，得到SPIO-ATF，經(jīng)PBS洗滌2遍后用300 μL PBS重懸，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ATF導(dǎo)入的驗(yàn)證

取30 μL SPIO-ATF溶液，100 ℃加熱10 min，將ATF與SPIO分離，在50 000 r/min條件下超速離心1 h后，取上清濃縮后進(jìn)行蛋白凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。

1.5 SPIO-ATF物理性質(zhì)的表征

利用透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100，Jeol，日本)對SPIO的γ-Fe2O3核心進(jìn)行觀察。利用動(dòng)態(tài)光散射分析儀(DLS，Nano ZS90 Zetasizer，Malvern，英國)測定SPIO和SPIO-ATF的水合直徑及Zeta電位。用雙蒸水將SPIO和SPIO-ATF溶液分別稀釋至鐵濃度為0.1 mg/mL，然后取1 mL待測溶液放于比色皿中，測量溫度設(shè)置為25 ℃，并在90°的測試角下進(jìn)行測定，粒度計(jì)算模型設(shè)置為General Purpose。

1.6 SPIO-ATF與4T1細(xì)胞結(jié)合能力的評價(jià)

在24孔板底部預(yù)先放置玻片，按照5×104個(gè)/孔的密度接種4T1細(xì)胞，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞在玻片上貼壁。然后將細(xì)胞分別與鐵濃度為50 μg/mL的SPIO、SPIO-ATF或PBS在37 ℃孵育4 h，或先與ATF(200 μg/mL)孵育30 min后再與SPIO-ATF孵育4 h。細(xì)胞經(jīng)過PBS洗滌3遍后用4%多聚甲醛在室溫下固定15 min并進(jìn)行普魯士藍(lán)染色。具體操作為：將5%亞鐵氰化鉀水溶液和5%鹽酸水溶液等體積混合，將其滴在細(xì)胞培養(yǎng)玻片上，室溫放置1 h后用雙蒸水洗滌，并加入伊紅染液復(fù)染。染色后將玻片取出并在光學(xué)顯微鏡(TH4-200，Olympus，日本)下觀察。

為了定量檢測細(xì)胞結(jié)合的氧化鐵納米顆粒，按照上述操作接種細(xì)胞并與SPIO或SPIO-ATF孵育后，收集細(xì)胞并向其中加入200 μL 6 M HCl以溶解氧化鐵納米顆粒。將細(xì)胞懸液在12 000轉(zhuǎn)/min條件下離心10 min后，取出100 μL上清置于新離心管中，用5% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至5～7，然后依次加入100 μL 10%鹽酸羥胺溶液，200 μL 0.15%鄰二氮菲溶液及500 μL 1 M醋酸鈉溶液，混勻后室溫放置10 min，通過酶標(biāo)儀(BioTek Synergy 4，BioTek，美國)檢測其在510 nm波長處的吸光值。利用已知鐵濃度的系列氯化鐵溶液(0、2、4、6、8、10 μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

為了進(jìn)一步探究SPIO-ATF和細(xì)胞的結(jié)合量與細(xì)胞中uPAR表達(dá)量的關(guān)系，首先將4T1細(xì)胞分別在含有10 μM SB203580[21]或10 ng/mL PMA[22]的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。之后通過蛋白質(zhì)印跡法檢測4T1細(xì)胞中uPAR的表達(dá)量，或?qū)⒓?xì)胞與鐵濃度為50 μg/mL的SPIO-ATF繼續(xù)孵育4 h，經(jīng)過4%多聚甲醛固定后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，并通過鄰二氮菲法定量測定細(xì)胞結(jié)合的SPIO-ATF。

1.7 SPIO-ATF的細(xì)胞毒性檢測

將4T1細(xì)胞按照1×104個(gè)/孔的密度種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼壁。然后將細(xì)胞與不同鐵濃度(5、12.5、25、50、100 μg/mL)的SPIO或SPIO-ATF溶液在37 ℃孵育24 h或48 h后棄掉培養(yǎng)基。用PBS將細(xì)胞洗滌2遍后，向每孔中加入含10% CCK-8反應(yīng)試劑(Dojindo Molecular Technologies，日本)的新鮮培養(yǎng)基120 μL并繼續(xù)孵育1.5 h。之后通過酶標(biāo)儀檢測上清液在450 nm波長處的吸光值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，未孵育材料的細(xì)胞作為陽性對照。

1.8 4T1細(xì)胞對SPIO-ATF的攝取

按照1.0×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度將4T1細(xì)胞接種到12孔板，培養(yǎng)過夜。然后將細(xì)胞與不同鐵濃度(0、5、12.5、25、50、100 μg/mL)的SPIO-ATF溶液孵育24 h，棄掉培養(yǎng)基并用PBS洗滌3遍。細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，并通過鄰二氮菲法測定細(xì)胞內(nèi)的鐵含量，具體操作同上。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異通過單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行分析，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 SPIO-ATF的制備和表征

本研究中用到的SPIO核心為γ-Fe2O3，外層包被羧甲基化葡聚糖，TEM照片顯示γ-Fe2O3核心的直徑小于10 nm(見圖1(a))。DLS測得SPIO的平均水合直徑為 (67.13±1.43) nm，偶聯(lián)ATF后平均水合直徑增加為 (76.59±1.67) nm(見圖1(c))。SPIO和SPIO-ATF的Zeta電位分別為 (-37.13±2.54) mV和 (-13.00±1.55) mV，Zeta電位的變化可能是由ATF的電荷屏蔽效應(yīng)引起的。

為了驗(yàn)證ATF是否偶聯(lián)到了SPIO上，將SPIO-ATF經(jīng)100 ℃加熱處理及離心后得到的上清進(jìn)行了蛋白凝膠電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果顯示，在分子量約17 kDa處能夠觀察到明顯的蛋白條帶(見圖1(b)，最右側(cè)泳道)，而未偶聯(lián)的ATF條帶也出現(xiàn)在相同的位置上(見圖1(b)，中間泳道)，這表明ATF已被成功導(dǎo)入到SPIO上，并且未發(fā)生降解或團(tuán)聚。

圖1 SPIO-ATF的理化學(xué)性質(zhì)表征。(a)SPIO的TEM照片；(b)通過蛋白凝膠電泳及考馬斯亮藍(lán)染色檢測與SPIO偶聯(lián)的ATF；(c)SPIO與SPIO-ATF的水合直徑分布Fig.1 Physicochemical characterization of SPIO-ATF. (a) TEM micrograph of SPIO; (b) The introduction of ATF to SPIO was confirmed by protein gel electrophoresis with Coomassie brilliant blue staining; (c) The hydrodynamic diameters of SPIO and SPIO-ATF

2.2 SPIO-ATF與4T1細(xì)胞結(jié)合能力的評價(jià)

圖2(a)是4T1細(xì)胞與SPIO或SPIO-ATF孵育4 h，或先經(jīng)過ATF預(yù)孵育后再與SPIO-ATF孵育4 h后的普魯士藍(lán)染色照片，結(jié)果顯示，SPIO組僅有少量藍(lán)染鐵顆粒可見，且主要分布于細(xì)胞外間隙；而SPIO-ATF組可見大量藍(lán)染鐵顆粒分布在細(xì)胞膜上，這表明SPIO-ATF更易于與細(xì)胞結(jié)合。而當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過ATF預(yù)孵育處理后，視野中的藍(lán)染鐵顆粒明顯減少，表明ATF預(yù)處理可以顯著抑制SPIO-ATF與4T1細(xì)胞的結(jié)合，提示SPIO-ATF是通過細(xì)胞表面的uPAR結(jié)合到細(xì)胞上的，從而在細(xì)胞水平上證明了SPIO-ATF良好的靶向性。而對細(xì)胞結(jié)合的氧化鐵納米顆粒的定量測定也進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果(見圖2(b))。

圖2 SPIO和SPIO-ATF與4T1細(xì)胞的結(jié)合能力。(a)4T1細(xì)胞分別與PBS、SPIO和SPIO-ATF孵育后，或經(jīng)ATF預(yù)處理的4T1細(xì)胞與SPIO-ATF孵育后的普魯士藍(lán)染色結(jié)果(標(biāo)尺：50 μm)；(b)鄰二氮菲法定量測定與4T1細(xì)胞結(jié)合的氧化鐵納米顆粒(*P<0.05)Fig.2 Binding capability of SPIO and SPIO-ATF with 4T1 cells. (a) 4T1 cells assessed by Prussian blue staining after the incubation with PBS, SPIO, SPIO-ATF, or SPIO-ATF with pre-treatment of ATF (scale bar: 50 μm); (b) Quantitative analysis of iron oxide nanoparticles bound with 4T1 cells determined by the o-phenanthroline method (*P<0.05)

圖3 4T1細(xì)胞uPAR表達(dá)量對其與SPIO-ATF結(jié)合量的影響。(a)4T1細(xì)胞與10 μM SB203580或10 ng/mL PMA孵育24 h后，用蛋白質(zhì)印跡法檢測uPAR的表達(dá)量；(b)經(jīng)過SB203580或PMA處理的4T1細(xì)胞與SPIO-ATF孵育4 h后的普魯士藍(lán)染色結(jié)果(標(biāo)尺：50 μm)；(c)經(jīng)過SB203580或PMA處理的4T1細(xì)胞與SPIO-ATF孵育4 h后，鄰二氮菲法定量測定4T1細(xì)胞結(jié)合的SPIO-ATF(* P<0.05)；(d)SPIO-ATF與細(xì)胞的結(jié)合量與uPAR相對表達(dá)量的相關(guān)性分析Fig.3 The influence of expression level of uPAR on the binding capability of SPIO-ATF with 4T1 cells. (a) Western blot analysis of the uPAR expression in 4T1 cells after treated with 10 μM SB203580 or 10 ng/mL PMA for 24 h; (b) Prussian blue staining of 4T1 cells after the incubation with SPIO-ATF for 4 h with the pre-treatment of SB203580 or PMA (scale bar: 50 μm); (c) Quantitative analysis of SPIO-ATF bound with 4T1 cells suffered different pre-treatments (* P<0.05); (d) The correlation between the amount of SPIO-ATF bound with cells and the relative expression level of uPAR

由蛋白質(zhì)印跡結(jié)果可知，4T1細(xì)胞經(jīng)10 μM SB203580處理24 h后，uPAR的表達(dá)量下降；而經(jīng)10 ng/mL PMA處理24 h后，uPAR的表達(dá)量上升(見圖3(a))。將經(jīng)過這兩種處理的細(xì)胞與SPIO-ATF孵育4 h后，進(jìn)行多聚甲醛固定及普魯士藍(lán)染色，結(jié)果顯示，經(jīng)過PMA處理的細(xì)胞結(jié)合的藍(lán)染鐵顆粒最多，而經(jīng)過SB203580處理的細(xì)胞結(jié)合的藍(lán)染鐵顆粒最少(見圖3(b))。用鄰二氮菲法對細(xì)胞結(jié)合的SPIO-ATF的定量測定也顯示了同樣的結(jié)果(見圖3(c))。而且，SPIO-ATF與細(xì)胞的結(jié)合量與uPAR的相對表達(dá)量顯示出了高度的相關(guān)性(見圖3(d))，從而進(jìn)一步表明SPIO-ATF與細(xì)胞的結(jié)合是由ATF與細(xì)胞上uPAR的相互作用介導(dǎo)的。

2.3 SPIO、SPIO-ATF對4T1細(xì)胞活性的影響

圖4顯示了4T1細(xì)胞在與SPIO或SPIO-ATF孵育24 h或48 h后的相對細(xì)胞活性。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度下，SPIO和SPIO-ATF均未表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。

圖4 不同孵育時(shí)間SPIO和SPIO-ATF對4T1細(xì)胞活性的影響。(a)24 h；(b)48 hFig.4 Cell viability of 4T1 cells after the incubation with SPIO or SPIO-ATF for different incubating times. (a) 24 h; (b) 48 h

2.4 4T1細(xì)胞對SPIO-ATF的攝取

將4T1細(xì)胞分別與不同鐵濃度的SPIO-ATF孵育24 h后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色。結(jié)果顯示，隨著鐵濃度的增大，4T1細(xì)胞對SPIO-ATF的攝取也逐漸增大，表現(xiàn)出一定的濃度依賴性(見圖5(a))。通過鄰二氮菲法對細(xì)胞中鐵含量的檢測也進(jìn)一步驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果(見圖5(b))。

圖5 4T1細(xì)胞對SPIO-ATF的攝取。(a)4T1細(xì)胞與不同鐵濃度的SPIO-ATF孵育24 h后進(jìn)行普魯士藍(lán)染色(濃度單位： μg/mL，標(biāo)尺：50 μm)；(b)鄰二氮菲法定量測定被4T1細(xì)胞攝取的SPIO-ATFFig.5 Cellular uptake of SPIO-ATF. (a) 4T1 cells assessed by Prussian blue staining after the incubation with different iron concentrations of SPIO-ATF for 24 h (concentration unit: μg/mL, scale bar: 50 μm); (b) Quantitative analysis of SPIO-ATF taken in by 4T1 cells using the o-phenanthroline method

3 討論

在SPIO上導(dǎo)入ATF后，結(jié)合到4T1細(xì)胞表面的氧化鐵納米顆粒明顯增多，而且SPIO-ATF與4T1細(xì)胞的結(jié)合量與細(xì)胞中uPAR的表達(dá)水平正相關(guān)。此外，用ATF提前處理細(xì)胞后，細(xì)胞結(jié)合SPIO-ATF的能力顯著下降。這些結(jié)果表明，SPIO-ATF可以特異性結(jié)合到4T1細(xì)胞上，而這種結(jié)合是通過ATF與uPAR的相互作用介導(dǎo)的。因此，利用SPIO-ATF能夠?qū)崿F(xiàn)對高表達(dá)uPAR細(xì)胞的靶向成像。

與一般的腫瘤特異性抗原不同，uPAR不僅在腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)，也在腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞上高表達(dá)[20]。這使得以uPAR為靶點(diǎn)的分子影像學(xué)探針有望實(shí)現(xiàn)對腫瘤微環(huán)境的靶向，從而大大增加其在腫瘤部位的聚集，使得對腫瘤微小病灶的識別成為可能，從而有望為原位腫瘤或轉(zhuǎn)移腫瘤的早期診斷提供一種新策略。而ATF包含uPAR的天然配體uPA氨基末端片段的135個(gè)氨基酸殘基，與uPA相比，ATF分子量小、成本低，更適合用于制備靶向探針。

在通常情況下，大部分靶向探針的構(gòu)建都是基于化學(xué)偶聯(lián)或生物素-親和素的方式[23-25]?；瘜W(xué)偶聯(lián)通常需要利用蛋白或多肽中的氨基或羧基等與載體發(fā)生反應(yīng)，有可能會(huì)影響蛋白或多肽的生理活性，而且難以滿足在使用前根據(jù)需要自由更換靶向探針，從而提高載體的通用性的需求。盡管生物素-親和素系統(tǒng)可以為探針的組裝提供高度的自由性，但這一體系的成本偏高，而且親和素分子量較大(約為68 kDa)，使得連接靶向分子后的顯影探針特別是小分子探針的尺寸變大，更容易被單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)所截留，從而縮短血液循環(huán)時(shí)間，不利于靶向成像的實(shí)現(xiàn)。His tags以及NTA-His tags系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種蛋白的純化中[26-27]。其成本低廉，且對探針尺寸的改變很小。因此，在本研究中，利用NTA-His tags系統(tǒng)構(gòu)建了一種通用的磁共振成像模塊(SPIO-NTA)。它可以偶聯(lián)各種含有His tags的蛋白或多肽，進(jìn)而構(gòu)建不同的靶向顯影探針，從而應(yīng)用于各種疾病的診斷。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了一種具有uPAR靶向性的MRI探針——SPIO-ATF。通過ATF與uPAR的相互作用，SPIO-ATF可以與乳腺癌細(xì)胞4T1特異性結(jié)合并被其攝取，展現(xiàn)出了良好的特異性靶向能力，從而有望實(shí)現(xiàn)對乳腺癌腫瘤微小病灶的早期MRI診斷。