張 磊， 黃慧玲， 楊 昂， 張 茜， 鄭春紅， 朱玉華， 劉松麟， 李印淑

（亞能生物實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518102）

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）檢測(cè)對(duì)于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、臨床診斷、病情監(jiān)測(cè)等具有重要意義，但CTC在腫瘤患者外周血中極為稀少，約為1～10個(gè)/mL，而正常成人外周血中血細(xì)胞數(shù)量為109個(gè)/mL，白細(xì)胞的數(shù)量是（4～10）×106個(gè)/mL[1-2]。CTC遠(yuǎn)低于血液中其他類型的細(xì)胞，數(shù)量的稀少使得血液CTC檢測(cè)極具挑戰(zhàn)性，加上CTC產(chǎn)生的復(fù)雜性、異質(zhì)性，更增加了其檢測(cè)的難度[3-4]。因此，如何從數(shù)量龐大的背景血液細(xì)胞中準(zhǔn)確地富集出幾個(gè)CTC，是CTC檢測(cè)技術(shù)需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究利用免疫磁珠和免疫熒光技術(shù)，建立一種高效、不依賴腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)志物、不依賴于腫瘤細(xì)胞大小的CTC陰性富集方法和免疫熒光鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

宮頸癌細(xì)胞系SiHa（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），活細(xì)胞熒光染料Celltracker CMFDA（美國(guó)Thermo Fisher公司）、Hoechst33342[生工生物工程（上海）有限公司]，熒光顯微鏡（日本尼康公司）。CTC陰性富集與免疫熒光鑒定試劑由亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司自主研發(fā)，其中試劑A主要包括緩沖液、白細(xì)胞去除磁珠；試劑B主要包括細(xì)胞固定液、細(xì)胞透化液、封閉液、抗體稀釋液、抗體濃縮液Ⅰ（含CK-異硫氰酸熒光素）和Ⅱ（含CD45-藻紅蛋白）、含DAPI抗淬滅封片劑等。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)與摻入 將SiHa細(xì)胞加入Celltracker CMFDA染色，用血球計(jì)數(shù)板精確計(jì)數(shù)至固定體積內(nèi)含有6、9、15、30、90、300個(gè)不同數(shù)量梯度的細(xì)胞，并摻入3 mL全血中，每組設(shè)6個(gè)組內(nèi)平行。

1.2.2 CTC陰性富集及免疫熒光鑒定 按照CTC陰性富集與免疫熒光鑒定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3 細(xì)胞回收率統(tǒng)計(jì) 制片后2 d內(nèi)直接觀察計(jì)數(shù)，7 d后進(jìn)行熒光染色，CTC表示為細(xì)胞核型完整，CK+CD45-Hoechst33342+。CTC富集回收率=染色CTC數(shù)量/摻入CTC總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 CTC陰性富集回收率

在3 mL健康人全血中分別摻入6、9、15、30、90、300個(gè)Celltracker CMFDA標(biāo)記的SiHa細(xì)胞，然后進(jìn)行免疫磁珠陰性富集并進(jìn)行Celltracker+Hoechst33342+染色、計(jì)數(shù)，設(shè)6批獨(dú)立試驗(yàn)。富集效率為58.33%～87.22%，平均為76.70%±14.79%，見(jiàn)表1。以3 mL血液中摻入的CTC數(shù)量為X，以CTC富集回收數(shù)量為Y，線性方程為Y=0.746 4X（r2=0.998 7），說(shuō)明線性關(guān)系良好，見(jiàn)圖1。

2.2 CTC檢測(cè)效率

免疫熒光鑒定后的CTC呈現(xiàn)典型的CK+CD45- Hoechst33342+形態(tài)特征見(jiàn)圖2。

因Celltracker熒光減弱、淬滅等原因，免疫熒光后CTC平均回收率比免疫熒光前高2.1%～12.6%，7 d后對(duì)免疫熒光試劑的影響減到最小，因此于7 d后進(jìn)行熒光染色。結(jié)果顯示，CTC回收率為62.50%～95.00%，平均回收率為83.05%，見(jiàn)表2。富集效率和染色回收效率結(jié)果對(duì)比顯示，免疫熒光操作不會(huì)減少富集后的CTC數(shù)量。

表1 CTC富集數(shù)及富集效率

圖1 CTC富集平均回收數(shù)量線性關(guān)系

圖2 CTC免疫熒光鑒定

表2 摻入不同數(shù)量CTC免疫熒光鑒定前后平均回收率比較 （%）

3 討論

目前，以上皮細(xì)胞黏附分子為腫瘤標(biāo)志物的CTC分離方法存在漏檢丟失上皮性抗原CTC的可能性[3-4]。以美國(guó)強(qiáng)生公司Cellsearch為代表的第1代CTC檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)早在2004年就通過(guò)美國(guó)食品和藥品管理局認(rèn)證，然而由于Cellsearch技術(shù)平臺(tái)捕獲CTC數(shù)量少、敏感性差、系統(tǒng)封閉，只能用于晚期惡性腫瘤患者，不適用于早、中期腫瘤及治療后患者，且臨床只用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌，運(yùn)用范圍窄[5]。因此，開發(fā)不依賴于CTC表面標(biāo)記物、敏感性高、系統(tǒng)開放性強(qiáng)的陰性富集方法對(duì)于CTC檢測(cè)技術(shù)具有重要意義。

本研究建立的CTC陰性富集法具有免疫熒光染色效果佳、無(wú)非特異性染色等特點(diǎn)，能有效富集血液中極少數(shù)量的CTC（3 mL血液中摻入6個(gè)細(xì)胞，平均能回收3.5個(gè)）。這預(yù)示著在外周血中含量較低的CTC可被檢測(cè)出來(lái)，更適用于早期診斷、療效監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷。且該方法不依賴于CTC表面標(biāo)志物，可運(yùn)用于不同類型的腫瘤患者，應(yīng)用范圍更廣，但仍需進(jìn)行大量樣本的臨床樣本研究證實(shí)，并且手工操作流程仍有待優(yōu)化。