童文羽 朱志強 曾 智

本試驗改進了農(nóng)業(yè)部783號公告-2-2006水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留量的高效液相色譜法，并對樣品的提取條件和色譜方法進行了優(yōu)化分析，確定使用鹽酸酸化乙腈提取，固相萃取小柱凈化，高效液相色譜-熒光檢測器檢測、外標法定量的分析方法。本方法漂移率小，對三種喹諾酮類藥物標準曲線回歸系數(shù)在0.999以上，線性范圍1～1000μg/L，定量限1μg/kg。對草魚、對蝦樣品進行三種喹諾酮類藥物加標回收率的驗證實驗，回收率在79.2%～105.0%之間，相對標準偏差在0.83%～9.85%之間，批次間標準偏差在5.00%～10.57%之間，說明方法前處理提取效率和準確度滿足分析要求。

1.材料與方法

1.1 儀器、試劑、標準品與耗材

試驗材料來自歷次農(nóng)業(yè)部例行采集樣品，品種有草魚和對蝦。

島津LC-20AD高效液相色譜儀（配熒光檢測器RF-20A），LC Solution工作站與Waters e2695高效液相色譜儀（配熒光檢測器2475），Empower 3工作站；色譜柱為Thermo Acclaim C18與安捷倫ZORBAX SBC18，規(guī)格均為4.6mm×250mm，I.D.5μm。

三種沙星標準品均為Dr.Ehrenstorfer。其中諾氟沙星純度為99.1%，環(huán)丙沙星純度為95.0%，恩諾沙星純度為99.0%。分別稱取諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星標準品各0.01g（精確至0.0001g），用色譜純級甲醇溶解，必要的時候使用超聲助融，定容到100mL棕色容量瓶中，4℃冷藏保存，有效期6個月。

試驗使用試劑及其他儀器規(guī)格如下（表1-表3）：

1.2 實驗前處理的優(yōu)化

1.2.1 樣品的處理方法

取魚、蝦肌肉，切成小塊，勻漿機打成勻漿后準確稱取5.00g（±0.05g）樣品，置于50mL離心管中，加入15mL提取劑，蓋緊蓋子，置于振蕩器上振蕩5min，4500r/min離心5min，上清液倒入另外一支50mL離心管中。

表1 試驗使用的各試劑品牌個規(guī)格

表4 甲酸酸化和鹽酸酸化的乙腈提取的回收率

表5 提取次數(shù)的回收率

1.2.2 提取液的選擇和優(yōu)化

根據(jù)農(nóng)業(yè)部783、1077號公告，選擇酸化乙腈作為提取劑，因為喹諾酮類都是兩性化合物，提取時在提取劑中加入酸會提高提取效率。分組使用100%乙腈、1%甲酸酸化和每2500mL提取劑加入20mL50%鹽酸進行酸化的乙腈作為提取劑，每次提取用量15mL。

表2 固相萃取小柱品牌、規(guī)格

表3 其他儀器規(guī)格型號

從表4可以看到，由于這三種喹諾酮類藥物都是兩性化合物，酸化的提取劑可以大大提高提取回收率，而提取實驗也證明了這一點。其中鹽酸酸化的乙腈作為提取劑的回收率最高，原因是鹽酸的酸性較甲酸強。同時，提取3次比2次顯著提高回收率。對提取次數(shù)進行進一步優(yōu)化結(jié)果如表5，提取4次后，諾氟沙星回收率有提高，但環(huán)丙沙星和恩諾沙星的回收率并沒有顯著提高，因此采用鹽酸酸化的乙腈作為提取劑，提取3次即可。

1.2.3 樣品的凈化方法的優(yōu)化

表6 3種固相萃取小柱以及不使用小柱的加標回收率

表7 方法的線性范圍、線性回歸方程、相關系數(shù)和檢測限

喹諾酮類因為是兩性化合物，所以在正己烷中的溶解度很差。因此正己烷在喹諾酮類的前處理過程中常用作去雜試劑。

旋轉(zhuǎn)減壓蒸餾或氮吹干提取液后，用2.0mL磷酸二氫鉀-甲醇溶液溶解殘渣（34.0g磷酸二氫鉀溶于230mL水，用25%氫氧化鈉調(diào)pH至7.0，用該溶液將20mL甲醇稀釋至100mL），在提取液中加入2mL正己烷，渦旋，靜置后去掉上層的正己烷，正己烷凈化操作需要進行2次，如果樣品基質(zhì)特別復雜，凈化次數(shù)可酌情增加。

根據(jù)唐巍、盧艷芬等人報道，水產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量測定前處理中可使用Waters Oasis HLB固相萃取小柱凈化，農(nóng)業(yè)部1025號公告則使用C18小柱，因此將包括這兩種小柱在內(nèi)的一共3種固相萃取小柱以及不使用固相萃取凈化分組做對比實驗。

所有的萃取小柱在使用前均使用3.0mL甲醇和3.0mL水激活萃取柱，C18、HLB、MCX、PRS小柱激活后加入備用樣品過柱，6.0mL純水淋洗去雜，用6mL的6%氨化甲醇（6mL氨水用甲醇稀釋至100mL）洗脫，收集洗脫液，于45℃氮吹至干，1.0mL流動相溶解殘渣，經(jīng)濾膜過濾，供液相色譜分析使用；

不使用固相萃取小柱凈化的對照組，在第一次氮吹后直接使用1mL流動相溶解殘渣,定容后過濾供液相測定使用。

圖1 流動相為乙腈：四丁基溴化銨-磷酸緩沖液體積比5∶95的標準品重疊圖

根據(jù)表6的統(tǒng)計，不使用萃取小柱回收率是很高的，缺點是色譜圖上的雜質(zhì)依然較多，而使用固相萃取小柱后，盡管回收率都出現(xiàn)了不同程度的降低，但從儀器圖譜上來看，使用固相萃取小柱可以顯著的減少雜質(zhì)峰，減少干擾。因此使用萃取小柱是有意義的。

1.3 色譜條件

農(nóng)業(yè)部783號公告中使用的是乙腈∶四丁基溴化銨-磷酸（pH3.1）=95∶5作為流動相，在實際實驗過程中發(fā)現(xiàn)以下幾個問題：

由于喹諾酮類屬于兩性分子，傳統(tǒng)的色譜柱常常會因為殘余硅醇基和金屬不純物的存在而導致色譜峰拖尾。在農(nóng)業(yè)部783號公告的方法中，在流動相中加入四丁基溴化銨試劑（3.22g四丁基溴化銨溶于1000mL水中，磷酸調(diào)pH值為3.1），作為離子對試劑降低其極性，從而改善峰形和提高分離度。但喹諾酮類樣品在色譜柱保留時間對pH 值很敏感，而離子對試劑本身無法起到有效的緩沖作用，可能造成目標物質(zhì)保留時間的漂移，如圖1。

可以看到乙腈-四丁基溴化銨流動相雖然峰型和分離度較好，但出現(xiàn)了在保留時間有漂移。同時流動相中的四丁基溴化銨很容易產(chǎn)生氣泡，即便長時間超聲脫氣也很難改善，因此參考農(nóng)業(yè)部1025號公告，使用乙腈-磷酸三乙胺（3.4mL濃磷酸溶于1000mL水中，三乙胺調(diào)pH值為2.4）作為流動相。其中乙腈：磷酸-三乙胺緩沖液體積比為18∶82，流速1.0mL/min；使用熒光檢測器，激發(fā)波長280nm，發(fā)射波長450nm；柱溫35℃；進樣量20μL。該色譜條件下的標準品疊加如圖2，可以看到目標峰的漂移相比乙腈-四丁基溴化銨作為流動相時改善了很多，而且出峰較快，節(jié)省了時間和流動相。

圖2 流動相為乙腈∶磷酸-三乙胺緩沖液=18∶82的標準品重疊圖

圖3 3種喹諾酮類標準品色譜圖（三種沙星均為5μg/L）

2.結(jié)果與討論

2.1 色譜分離

在優(yōu)化出的色譜條件下，分析得到標準溶液、空白和加標樣品的色譜圖，見圖4?？梢钥吹剑谒褂玫纳V條件下，目標峰得到了很好的分離。

2.2 檢出限和定量限

取三種喹諾酮類標準儲備液，用流動相稀釋成標準工作液，在優(yōu)化出的色譜條件下進樣，以各組分質(zhì)量濃度與色譜峰面積進行線性回歸，繪制工作曲線，得到回歸方程如表7。

因為實際工作中樣品的基質(zhì)較為復雜，因此，為減少雜峰干擾，故選用了10倍信噪比（S/N）計算儀器檢出限，諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星的儀器檢出限為0.20μg/L、0.30μg/L、0.45μg/L。同時，根據(jù)加標實驗情況以及同時測定的要求，確定三種沙星的定量限為1.0μg/Kg。

表8 方法的回收率

表9 方法的精密度

2.3 回收率和精密度

分別對草魚和對蝦樣品加標，測定加標回收率和方法精密度。測定結(jié)果見表8-9，三種喹諾酮類在草魚和對蝦兩種樣品中的平均回收率在79.2%～105.0%之間，相對標準偏差在0.83%～9.85%之間，批次間相對標準偏差在5.00%～10.57%之間。

2.4 結(jié)論

本研究采用了鹽酸酸化乙腈提取、正己烷和Oasis MCX固相萃取小柱凈化，使用乙腈-磷酸三乙胺作為流動相，建立了水產(chǎn)品中恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星殘留量的高效液相色譜-熒光檢測測定方法。該方法較之農(nóng)業(yè)部783號、1025號公告方法有著定性、定量更加準確，精密度高，重現(xiàn)性好，能滿足我國現(xiàn)行獸藥殘留檢測分析要求，可用于水產(chǎn)品中諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星藥物殘留量的測定。