不同濕地土壤中真菌群落分析以及纖維素降解菌的篩選

夏俊

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

纖維素是地球上最豐富、來源最廣泛的碳水化合物，也是最大的可再生資源，占地球生物量的近50%[1]。纖維素、半纖維素和木質(zhì)纖維素的致密結(jié)構(gòu)形成的保護(hù)層造成纖維素不易降解，而難以作為碳源被直接轉(zhuǎn)化利用[2]。目前，以纖維素、半纖維素和木質(zhì)素形式存在的可再生性木質(zhì)纖維素資源的再生轉(zhuǎn)化，通過微生物降解轉(zhuǎn)化為可利用性還原糖并用以生產(chǎn)生物乙醇、生物柴油等可再生能源正成為世界產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要趨勢(shì)[3]。目前發(fā)現(xiàn)的具有木質(zhì)纖維素降解能力的微生物種類十分廣泛，但相關(guān)研究多集中于真菌，如里氏木霉、白腐真菌、黑曲霉等[4-6]。但大部分用于纖維素酶生產(chǎn)的菌株存在酶活力較低的問題。

本項(xiàng)目采集來自于濕地公園樹木聚集區(qū)的表層土壤，提取土壤原樣基因組，通過Illumina高通量測(cè)序方法對(duì)各樣品基因組中的ITS（真菌）進(jìn)行測(cè)定，然后對(duì)樣品中的真菌的種類以及所占比例進(jìn)行分析和比較，得出各樣品中真菌的組成成分，同時(shí)從土壤中篩選分離能高效降解纖維素的真菌。

1 材料與方法

1.1 樣品及培養(yǎng)基

樣品采集：在南昌濕地公園選取三處樹木茂密的區(qū)域SY1、SY2、SY3，除去表面腐殖層在土層5～10 cm深度取樣，土樣過篩去除根及石塊，存儲(chǔ)于-80 ℃冰箱中待用。

Mandel營 養(yǎng) 液：NaNO32 g，K2HPO41.5 g，CaCl21.5 g，MgSO40.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，MnSO4·H2O 0.001 6 g，ZnSO4·H2O 0.001 4 g，CoCl20.0005 g，H2O 100 mL，pH 5.5。

羧甲基纖維素（CMC）平板培養(yǎng)基：Mandel營養(yǎng)液，2%羧甲基纖維素，0.08%的脫氧膽酸鈉，1.5%的瓊脂。

纖維素濾紙液體培養(yǎng)基：Mandel營養(yǎng)液，1 cm×6 cm的濾紙條一張。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，H2O 1 000 mL，115 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 基因組DNA提取及測(cè)序

使用土壤基因組提取試劑盒（上海生工）按說明提取土壤基因組DNA，提取的DNA溶液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3 測(cè)序結(jié)果分析

將測(cè)序初始序列去除接頭、barcode和前引物序列，再去除低質(zhì)量序列后得到的優(yōu)質(zhì)序列用于后續(xù)分析研究。用mothur對(duì)所得序列進(jìn)行分析，以97%相似性為標(biāo)準(zhǔn)劃分操作分類單元（OTU）并進(jìn)行多樣性指數(shù)分析計(jì)算：群落豐度的指數(shù)Chao和Ace；群落多樣性的指數(shù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)；測(cè)序深度指數(shù)Coverage。在OTU聚類結(jié)果的基礎(chǔ)上，獲取每一個(gè)OTU聚類中的代表性序列與RDP classifier數(shù)據(jù)庫（http://rdp.cme.msu.edu/misc/resources.jsp）中的已知數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，得到各OTU代表序列的分類學(xué)信息，并在門綱目科屬種水平統(tǒng)計(jì)各個(gè)樣品的群落組成。

1.4 纖維素降解菌的篩選

1.4.1 初篩

稱取土樣10 g，加入90 mL無菌水，振蕩充分混合 后制 成 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和 10-9稀釋度的土壤溶液。吸取200 μL稀釋溶液涂布于羧甲基纖維素平板培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4天后上挑取長(zhǎng)勢(shì)明顯的絲狀真菌菌落接種于羧甲基纖維素平板培養(yǎng)基上，30 ℃靜置培養(yǎng)3～4天，待菌絲長(zhǎng)出后，再次接種于新的羧甲基纖維素培養(yǎng)基，直至獲得純菌株。

1.4.2 剛果紅染色

加入10 mL染色液于培養(yǎng)基中，浸染30 min；染色結(jié)束后用1 mol/L氯化鈉溶液和蒸餾水洗交替脫相，洗去殘留菌絲，再用氯化鈉反復(fù)洗脫至洗液透明；觀察菌落大小，測(cè)透明圈直徑，并計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑之比（HC）。

1.4.3 復(fù)篩

將初篩獲得的菌株按10%的接種量分別接種于液體CMC培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)7天后測(cè)其羧甲基纖維素酶活。

1.5 菌種鑒定

利用通用引物ITS1/ITS4對(duì)篩選所得菌種的保守序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR引序列為ITS1（5’-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3’)，ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[7]。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s；循環(huán) 30 次；72 ℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序獲得DNA序列后，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫Blast分析鑒定所得纖維素降解真菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)

2.1.1 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用Illumina測(cè)序方法，經(jīng)優(yōu)化后得到各樣地土壤樣品中微生物18S rDNA 基因序列118 083條，平均長(zhǎng)度為439 bp。樣品物種稀釋性曲線如圖1所示，土壤樣品的稀釋曲線已處在平穩(wěn)期，因此本次測(cè)序能代表土壤中真菌的真實(shí)情況。

圖1 稀釋性曲線

2.1.2 土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

土壤真菌群落多樣性分析見表1，各樣本的Coverage都大于0.999，表明取樣深度都比較合適。3個(gè)樣本的Shannon指數(shù)平均值由高到低依次為SY2＞SY1＞SY3，Simpson指數(shù)平均值由低到高依次SY2＜SY1＜SY3。由此可見，樣本SY2的真菌多樣性較為豐富。

表1 土壤真菌群落多樣性分析

三個(gè)樣本中共有6個(gè)真菌門（圖2）。其中子囊菌門（Ascomycota）相對(duì)豐度最大，在各樣品中均占75%以上，且SY1和SY3中的相對(duì)豐度大于SY2。其次是擔(dān)子菌（Basidiomycota）和接合菌（Zygomycota），SY3的擔(dān)子菌豐度大于SY1和SY2，而接合菌豐度小于另外兩者。

圖2 各土樣中真菌門相對(duì)豐度

三個(gè)真菌群落中相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)真菌屬共有15個(gè)（圖3）。其中SY1中粘帚霉屬（Gliocladium）豐度最高，而SY3中沒有粘帚霉；其次是鐮刀霉屬（Fusarium）和漆斑霉屬（Myrothecium），但它們?cè)赟Y2和SY3中豐度都較低；SY2中豐度較高的木霉屬（Trichoderma）、綠僵菌屬（Metarhizium）和枝氯霉屬（Ramichloridium）在另外兩個(gè)樣本中含量也不高；SY3中豐度最高的是毛束霉屬（Trichurus）和枝孢酶屬（Cladosporium），毛束霉屬在SY1中不存在，而枝孢酶屬在另外兩者豐度也較低。由此可見，各土樣中的真菌菌群存在很大的差異。

圖3 各樣本中優(yōu)勢(shì)菌屬的相對(duì)豐度

2.2 纖維素降解菌的篩選與鑒定

2.2.1 維素降解菌的篩選

挑取在以纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速的絲狀真菌，進(jìn)行剛果紅染色，以透明圈的形成和大小大致反映該菌的產(chǎn)酶能力。本實(shí)驗(yàn)挑取了17個(gè)霉菌，在雙層平板上培養(yǎng)3天，剛果紅染色，測(cè)量透明圈的直徑。具有纖維素降解能力的菌，經(jīng)剛果紅染色后形成了比較明顯的透明圈，分析透明圈直徑與菌落直徑之比（HC），挑選出HC＞1的菌12株如表2所示。

表2 剛果紅染色結(jié)果：部分真菌的HC比較

將初篩的12株菌株接種到纖維素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7天后測(cè)其羧甲基纖維素酶活，結(jié)果見圖4。從圖4中可以看出，SY2-4、SY2-9、SY2-7、SY2-2、SY1-5、SY3-3這幾株菌的酶活相對(duì)較高，達(dá)到80 U/mL以上，其它的都為24 U/mL以上。

2.2.2 纖維素降解菌的鑒定

本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)分析法，對(duì)篩選到的真菌菌株進(jìn)行鑒定。分別用通用ITS1/ITS4對(duì)SY2-4、SY2-9、SY2-7、SY2-2、SY1-5和 SY3-3的 ITS保守區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增并序列測(cè)定，經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫Blast分析表明初步判定SY2-4、SY2-9、SY2-7、SY2-2、SY1-5和SY3-3分別為木霉（Trichoderma sp.）、青霉（Penicillium sp.）、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）、尖孢鐮刀霉（Fusarium sp.）、黑曲霉（Aspergillusniger）和米曲霉 （Aspergilluoryzae）。

圖4 液體發(fā)酵中真菌羧甲基纖維素酶活的測(cè)定

3 結(jié)論

三個(gè)樣地中共有6個(gè)真菌門和15個(gè)優(yōu)勢(shì)真菌屬，其中，子囊菌門和擔(dān)子菌門豐度最高。粘帚霉屬、鐮刀霉屬和漆斑霉屬是SY1中的優(yōu)勢(shì)菌屬，木霉屬、綠僵菌屬和枝氯霉屬是SY2中的優(yōu)勢(shì)菌屬；毛束霉屬和枝孢酶屬在SY3中豐度最高。由此可見，不同采樣點(diǎn)的土壤菌群差異較大，這可能跟植被類型、土壤pH、濕度等條件有關(guān)。

通過分子生物學(xué)方法鑒定可知篩選得到的產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的真菌分別為木霉（Trichoderma sp.）、青霉（Penicillium sp.）、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）、尖孢鐮刀霉（Fusarium sp.）、黑曲霉（Aspergillusniger）和米曲霉（Aspergilluoryzae）。對(duì)這些降解菌還需要更加深入的研究，為后續(xù)纖維素高效降解菌劑的構(gòu)建以及降解菌種的改造提供基礎(chǔ)。