四種植物水提液對(duì)胡蘿卜軟腐病菌的抑制效果研究

賀理，陳潔，陳曦，張睿，陳存

（成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 611130）

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中，農(nóng)作物經(jīng)常會(huì)遭受各種病蟲害，其中植物病原細(xì)菌引起的植物病害尤為明顯。胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora）是多種植物的病原細(xì)菌，它主要侵害植物地下部肉質(zhì)根，造成植物的軟腐與濕腐，如果侵染維管束組織，會(huì)阻礙水分輸送而導(dǎo)致地上葉片出現(xiàn)萎蔫等癥狀[1]，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大危害，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。近年來(lái)，人們對(duì)于綠色安全越來(lái)越關(guān)注，逐漸把目光投向生物抑菌劑，其中植物源抑菌劑由于其提取工藝簡(jiǎn)單、效果顯著、無(wú)環(huán)境污染而備受人們青睞[2]，因此，對(duì)新型植物源性質(zhì)抑菌抗菌物質(zhì)的研究也愈加重視。大蒜（Allium sativum）、柑橘（Citrus reticulata）、洋蔥（Allium cepa）、柚子[Citrus maxima (Burm)]等植物具有其特有的抗菌特效，在研發(fā)植物抗菌劑方面具有廣闊的應(yīng)用前景[3-8]。

本研究采用4種天然植物水提取液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，篩選具有較高生物活性的植物，為其抑制植物病原細(xì)菌以及控制植物病害的發(fā)生等提供理論依據(jù)。該方面的研究成果對(duì)發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)、促進(jìn)綠色食品工業(yè)的發(fā)展、構(gòu)建人與自然環(huán)境的和諧發(fā)展等方面具有十分深遠(yuǎn)的意義[9]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種

胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora，BNCC138474）菌種凍干粉，購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.1.2 供試植物樣品

植物樣品供試部位及產(chǎn)地詳見表1。

表1 供試植物樣品表

1.1.3 主要儀器及試劑

儀器設(shè)備：不銹鋼整體式游標(biāo)卡（DL92150，Deli）；高效液相色譜儀（CBM20A, Shimadzu）。

試驗(yàn)藥品：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）、瓊脂粉、乙腈（色譜純）、去離子水等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的活化及菌懸液的制備

胡蘿卜軟腐歐文氏菌菌種凍干粉加入無(wú)菌水混勻，接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯平板培養(yǎng)基上，待其生長(zhǎng)成熟，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至菌液OD值約為0.6時(shí)停止培養(yǎng)，放入4 ℃冰箱備用。

1.2.2 天然植物水提液的制備

大蒜鱗莖剝皮、柑橘皮、洋蔥鱗葉剝皮、柚子皮切碎研磨后各稱取20 g，按1∶3比例加入去離子水，室溫下密封浸提4 h，紗布過(guò)濾，濾液在離心機(jī)10 000 r/min下離心20 min，取上清液通過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜，得到4種植物水提液，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 天然植物水提液抑菌試驗(yàn)

將4個(gè)滅菌后的牛津杯依次放置在配制好的NB固體培養(yǎng)基上，分別加入100 μL 4種植物水提液（大蒜鱗莖水提液稀釋2倍），置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)3個(gè)平板。24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 大蒜鱗莖水提液的液相色譜分析

對(duì)大蒜鱗莖水提液中的有效抑菌成分進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）分析，分析條件如下，色譜柱：C18柱（250 mm×4.5 mm），流動(dòng)相：乙腈/水=30/70（V/V），Diode Array檢測(cè)器，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量100 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 四種天然植物水提液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑菌效果

試驗(yàn)分別測(cè)定了4種植物水提液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑菌效果，用游標(biāo)卡尺測(cè)量4種植物水提液抑菌圈直徑，結(jié)果見表2。可以看出，4種植物水提液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑制效果不同，大蒜鱗莖、柑橘皮、洋蔥鱗葉、柚子皮水提液形成的抑菌圈直徑分別為24.73 mm、5.03 mm、17.8 mm、4.72 mm，說(shuō)明4種植物水提液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌的抑菌作用強(qiáng)度依次為大蒜鱗莖水提液＞洋蔥鱗葉水提液＞橘皮＞柚子皮水提液。

2.2 HPLC對(duì)大蒜鱗莖水提液有效抑菌成分的分析

利用高效液相色譜對(duì)大蒜鱗莖水提液的有效抑菌成分進(jìn)行分析，得到液相色譜分析結(jié)果如圖1和表3?？梢钥闯?，大蒜鱗莖水提液中可能的有效抑菌成分有7種，對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌明顯的抑菌效果可能是這7種成分中一種或幾種共同作用的結(jié)果。

圖1 大蒜鱗莖水提液液相色譜分析圖譜

表2 四種植物水提液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌形成的抑菌圈直徑

表3 大蒜鱗莖水提液液相色譜分析圖譜數(shù)據(jù)記錄

3 討論

試驗(yàn)中，大蒜鱗莖水提液在稀釋兩倍后進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其抑菌效果依然明顯強(qiáng)于其他3種植物水提液，表明大蒜具有超強(qiáng)殺菌能力。洋蔥鱗葉水提液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌也有一定的抑菌效果，但抑菌效果不如大蒜，而柑橘皮和柚子皮水提液沒(méi)有明顯的抑菌效果。一些研究報(bào)道中，大多用有機(jī)物提取橘皮和柚子皮中的抑菌活性成分。李凌緒等發(fā)現(xiàn)，橘皮石油醚提取物的抑菌效果最好，水提取物的抑菌效果最差，說(shuō)明橘皮中主要抑菌活性成分可能是低極性物質(zhì)[10]。此外，唐俊妮等證實(shí)，不同洋蔥品種的抑菌效果也會(huì)有差異，紫皮洋蔥抑菌效果要稍優(yōu)于白皮洋蔥[11]。因此，同種植物的不同品種的抑菌效果也可能不同?？得懒岬难芯空J(rèn)為洋蔥原汁的抑菌效果要強(qiáng)于洋蔥提取物的抑菌效果[12]。由此可以思考，是否大蒜原汁、洋蔥原汁、橘皮精油和柚子皮精油的抑菌效果更好，尚需進(jìn)一步研究。

對(duì)大蒜鱗莖水提液進(jìn)行高效液相色譜分析的結(jié)果表明，大蒜鱗莖水提液中含有7種可能的有效抑菌成分，具體的成分需要做氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）才能得到進(jìn)一步分析，具體是哪一種或哪幾種成分能夠真正抑菌，還需將各成分收集起來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，才能分析得出結(jié)論。

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大蒜鱗莖水提液和洋蔥鱗葉水提液對(duì)胡蘿卜軟腐歐文氏菌有抑菌作用，且大蒜鱗莖水提液效果明顯。這為防治胡蘿卜軟腐歐文氏菌對(duì)農(nóng)作物的危害提供了初步理論依據(jù)，期望能夠在這一方面繼續(xù)挖掘其價(jià)值，推動(dòng)植物源殺菌劑應(yīng)用開發(fā)的研究進(jìn)程，促進(jìn)生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品工業(yè)的發(fā)展，創(chuàng)造人與自然和諧共存的美好未來(lái)。