楊浩宇

（長安大學(xué)材料學(xué)院高分子材料與工程系，陜西西安 710021）

皮膚是人體最大的器官，在抵御病原微生物入侵、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有重要的作用。當(dāng)皮膚損傷時，傷口敷料能夠起到維持創(chuàng)面濕潤環(huán)境、預(yù)防感染和防止二次傷害等作用[1]，進(jìn)而加快皮膚愈合，改善愈合質(zhì)量。當(dāng)傷口較大，甚至損傷大血管時，患者出血量較大，嚴(yán)重時會導(dǎo)致患者死亡。在此背景下，開發(fā)具備止血促凝功能的新型傷口敷料具有顯著的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)價值。

大豆分離蛋白是一種從天然大豆中提取出的球型蛋白質(zhì)，具有儲量豐富、價格低廉、對環(huán)境無污染等優(yōu)勢，近年來在人造塑料、藥物載體、包裝材料等領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用[2]。與此同時，大豆分離蛋白還具有良好的細(xì)胞相容性、血液相容性和低免疫原性，在組織工程方面具有一定的應(yīng)用潛力[3]。陳云等制備了一種戊二醛交聯(lián)的羥乙基纖維素/大豆分離蛋白復(fù)合膜，并在促進(jìn)傷口愈合方面取得了一定的效果[4]。

γ-聚谷氨酸是經(jīng)由芽孢桿菌發(fā)酵制備的一種高分子聚合物，具有極佳的親水保濕性能，并且可在生物體內(nèi)溶菌酶的作用下降解[5]。γ-聚谷氨酸具有一定的生物活性，其降解產(chǎn)物谷氨酸可被細(xì)胞膜表面谷氨酸受體識別。此外，γ-聚谷氨酸還具有良好的止血促凝的效果[6]。將γ-聚谷氨酸混入大豆分離蛋白中，可能賦予大豆分離蛋白膜新的特性。

在前期的工作中，筆者制備了大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸物理共混膜。該物理共混膜遇水極易溶解。為了進(jìn)一步增強(qiáng)復(fù)合膜的耐水性能，采用乙二醇二縮水甘油醚對兩種組分進(jìn)行了交聯(lián)，所獲得的大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸的耐水性和力學(xué)強(qiáng)度可以得到顯著的提升[7]。

在本次研究中，以大豆分離蛋白和γ-聚谷氨酸為主要原料，乙二醇二縮水甘油醚為交聯(lián)劑，通過溶液干燥法制備了大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜。通過掃描電子顯微鏡對復(fù)合止血膜的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察，采用MTT實驗和血漿抗凝實驗對復(fù)合止血膜的細(xì)胞相容性和促凝血作用進(jìn)行了評價。希望該大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜具有良好的細(xì)胞相容性和止血促凝效果，并能作為新型傷口敷料應(yīng)用于皮膚組織工程領(lǐng)域。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

大豆分離蛋白：蛋白干基＞90%（億鑫生物科技有限公司）；γ-聚谷氨酸：含量＞99%（福瑞達(dá)生物科技有限公司）；乙二醇二縮水甘油醚：AR（常州市潤翔化工有限公司）；乙醇：AR（江西同盟試劑化工廠）；氫氧化鈉：GR（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；冰醋酸：AR（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；85-2型機(jī)械攪拌機(jī)：金壇市新航儀器廠；LGJ-18型大容量冷凍離心機(jī)：北京華瑞科學(xué)器材。

1.2 樣品的制備

將10g大豆分離蛋白分散在60g去離子水中，然后加入30g5%氫氧化鈉溶液，充分?jǐn)嚢璧玫劫|(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%大豆分離蛋白溶液。將3gγ-聚谷氨酸溶解在97g去離子水中，達(dá)到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的γ-聚谷氨酸溶液。將上述的兩種溶液混合，其中大豆分離蛋白與γ-聚谷氨酸的質(zhì)量比為2:1。向上述的共混溶液中加入占總?cè)苜|(zhì)干重50%的乙二醇二縮水甘油醚，繼續(xù)機(jī)械攪拌10min。將溶液轉(zhuǎn)移到離心管中，3000r/min離心15min脫氣泡，將溶液倒入平皿中，溶液的厚度為5mm。溶液自然晾干后揭膜，浸入5%醋酸溶液中30min中和氫氧化鈉，然后流水沖洗48h，再次晾干得到大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜。

1.3 掃描電子顯微鏡觀察

將復(fù)合止血膜材料經(jīng)過液氮冷凍10 min，低溫淬斷，隨后真空干燥4 h，將樣品的斷面貼于銅臺表面并離子濺射儀噴金鍍膜。在20 kV冷場加速電壓下，觀察復(fù)合膜表面和斷面的形態(tài)。

1.4 MTT實驗

將膜材料粉碎，高壓滅菌20 min，烘干備用。按照“樣品質(zhì)量（g）/浸提介質(zhì)（mL）=0.2 g/mL”的比例，稱取材料樣品1 g，加入5 mL的RPMI1640培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中于37 ℃環(huán)境下72h。隨后1000 r/min離心10 min，提取上清液作為浸提液。消化L929細(xì)胞，以濃度為1×103cells/mL的細(xì)胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板中。設(shè)置陰性對照組以及空白對照組，然后置于37 ℃，5% CO2下培養(yǎng)箱中孵化24h。隨后棄去原培養(yǎng)液，加入無菌PBS漂洗；加入培養(yǎng)基并在實驗組加入50 μL樣品浸提液，陰性對照組依舊加入等量完全培養(yǎng)基；繼續(xù)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。隨后以20 μL/孔的比例往96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入濃度為5 mg/mL的噻唑藍(lán)（MTT）溶液并在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩幾分鐘后用酶標(biāo)儀檢測在495 nm處各孔的吸光光度值（OD）。

1.5 血漿抗凝實驗

收集新鮮兔血，并立即與3.8%檸檬酸三鈉溶液按9∶1的比例混合均勻。將上述的全血于3000r/min離心15min，收集上清得到乏血小板血漿。將復(fù)合膜材料剪成1 mm×1mm片狀，烘干備用?；罨糠帜蠲笗r間試劑盒購于南京建成試劑有限公司，檢測過程參照商業(yè)試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜的微觀結(jié)構(gòu)

復(fù)合止血膜材料的微觀形貌通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察得到。如圖1所示，復(fù)合膜材料的表面和斷面均較為光滑，并無微相分離現(xiàn)象發(fā)生，提示大豆分離蛋白分子和γ-聚谷氨酸分子之間具有良好的親和性。這種現(xiàn)象可部分歸因于乙二醇二縮水甘油醚的交聯(lián)作用。在交聯(lián)劑的作用下，組分高分子之間形成了廣泛的化學(xué)交聯(lián)和氫鍵交聯(lián)，有助于提高復(fù)合膜的穩(wěn)定性、耐水性和力學(xué)強(qiáng)度。

圖1 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜的表面和斷面結(jié)構(gòu)

2.2 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜的細(xì)胞相容性

小鼠成纖維細(xì)胞系（L929）可模擬動物皮膚細(xì)胞，廣泛用于評價止血材料的細(xì)胞相容性。細(xì)胞相容性通過MTT實驗評價。如圖2所示，浸提液處理組的相對增殖率與對照組相比在第一天沒有顯著性的差異。在第2天和第3天，浸提液處理組的相對細(xì)胞增殖率逐漸降低，說明復(fù)合止血膜材料對皮膚細(xì)胞生長具有一定的抑制作用。然而，浸提液處理組的相對細(xì)胞增殖率始終超過80%，參照細(xì)胞毒性分級標(biāo)準(zhǔn)GB/T168886.5-2003，該大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜的細(xì)胞毒性達(dá)到了生物醫(yī)用材料1類標(biāo)準(zhǔn)，滿足傷口敷料細(xì)胞毒性的一般要求。

圖2 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜細(xì)胞相容性的結(jié)果

2.3 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜的促凝血功能

復(fù)合止血膜的促凝血功能通過新鮮兔乏血小板血漿測定。如圖3所示，正常對照組的活化部分凝血活酶時間APTT為（28.77±0.66）s，在正常參考范圍之內(nèi)。復(fù)合止血膜處理組的活化部分凝血酶原時間APTT為（24.80±0.86）s，顯著低于正常對照組，其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。上述實驗結(jié)果表明：大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜能夠激活血漿內(nèi)源性凝血途徑和共同途徑，具有一定的止血促凝功效，有望應(yīng)用于傷口止血。

圖3 大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜的活化部分凝血活酶時間

3 總結(jié)

本研究制備了一種乙二醇二縮水甘油醚交聯(lián)的大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜。掃描電子顯微鏡的結(jié)果表明該復(fù)合止血膜具有均一的表面和斷面結(jié)構(gòu)，組分高分子之間具有良好的親和性。MTT實驗結(jié)果表明該復(fù)合止血膜具有較好的細(xì)胞相容性，符合生物材料1類標(biāo)準(zhǔn)。血漿抗凝實驗結(jié)果表明該復(fù)合止血膜能夠激活內(nèi)源性凝血途徑和共同通路途徑，具有一定的止血促凝效果。本研究制備的大豆分離蛋白/γ-聚谷氨酸復(fù)合止血膜可以作為新型傷口敷料，有望應(yīng)用于皮膚組織工程領(lǐng)域。