血清5型和13型副豬嗜血桿菌二價(jià)滅活苗的制備和免疫效果評(píng)價(jià)

朱 璐，范小兵，王正皓，代 科，文心田，曹三杰，趙 勤，文翼平

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/豬病研究中心，成都 611130）

副豬嗜血桿菌病又稱格拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）引起的以豬漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎等為特征的疾病[1]。副豬嗜血桿菌病一般發(fā)生于斷奶后和保育階段，感染后的發(fā)病率為10%～15%，發(fā)病豬的死亡率可達(dá)50%[2]。近些年，隨著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，該病臨床發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升趨勢(shì)，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。P.Kielstein等[5]通過(guò)SPF豬感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)HPS有 15個(gè)以上的血清型，其中血清型 1，5，10，12，13，14為強(qiáng)毒株。不同地區(qū)之間流行的血清型不同，其對(duì)豬造成的致病性也不同[6]。目前，接種疫苗是控制這一疾病的有效方法之一[7]，由于不同血清型菌株間交叉保護(hù)力不足，導(dǎo)致市售商品苗不能切實(shí)有效保護(hù)當(dāng)?shù)亓餍芯甑母腥綶8]。蔡旭旺等[9]和Zhang J.等[10]研究表明，當(dāng)前我國(guó)HPS流行的優(yōu)勢(shì)血清型主要為4、5、12、13型等。本實(shí)驗(yàn)室近兩年在四川地區(qū)成功分離HPS菌株100余株，血清型鑒定結(jié)果表明，其中5型和13型分離株最多[11]，且5型和13型均為強(qiáng)毒血清型[5]。S.Oliveira等[12]研究表明，HPS的免疫原性隨菌株不同而不同，且認(rèn)為毒力較高的HPS菌株其免疫保護(hù)力也較高。因此本實(shí)驗(yàn)選擇了血清5型和血清13型HPS強(qiáng)毒株作為對(duì)象，進(jìn)行了二價(jià)滅活苗的初步研制和免疫效果評(píng)價(jià)，為副豬嗜血桿菌病疫苗的研發(fā)和該病的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

血清5型MC-203株和血清13型XJ-103株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心分離鑒定并保存。14日齡哺乳仔豬和35日齡斷奶仔豬購(gòu)自四川省阿壩州茂縣生豬養(yǎng)殖有限公司，并經(jīng)ELISA試劑盒檢測(cè)HPS抗體呈陰性，嚴(yán)格隔離飼養(yǎng)。

1.2 材料

Tryptic Soy Agar（TSA）和Tryptic Soy Broth（TSB）（Oxoid）、NAD（Roche）、犢牛血清（Gibico）、鋁膠佐劑（中牧生物科技有限公司）、ELISA試劑盒（美國(guó)愛(ài)德士生物科技公司）、HPS國(guó)產(chǎn)商品疫苗、HPS進(jìn)口商品疫苗、TSA，TSB配置后添加5%犢牛血清和10 μg/mL的NAD、實(shí)驗(yàn)所涉及的其他各種試劑、藥品均為分析純。

1.3 二價(jià)滅活苗的制備

MC-203株和XJ-103株于TSB培養(yǎng)基中復(fù)蘇，劃線接種于TSA中連續(xù)傳代，挑單菌落接種于TSB中，37℃培養(yǎng)12 h，收集菌液。各取少量收集的菌液，分別加入總體積為0.2%的甲醛，置于37℃滅活，每隔 2～4 h 搖勻一次。分別在第 14、16、18、20、22、24 h取少量的滅活菌液接種于TSA上置于37℃培養(yǎng)24 h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。用PBS將滅活后的菌液重懸為1.0×1010個(gè)/mL，將MC-203株的菌液和XJ-103株的菌液等體積混合，再向混合菌液中加入等體積的佐劑（鋁膠）混合均勻，分裝至無(wú)菌瓶加蓋密封，置4℃冰箱保存。按常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)研制的二價(jià)苗進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)[13]。

1.4 二價(jià)滅活苗的安全性檢驗(yàn)

選取14日齡的哺乳仔豬和35日齡的斷奶仔豬各10頭，隨機(jī)分為兩組，I組疫苗組（14日齡和35日齡各5頭）頸部肌肉注射2 mL滅活苗，II組對(duì)照組（14日齡和35日齡各5頭）頸部肌肉注射2 mL無(wú)菌PBS。觀察接種后豬的精神狀態(tài)、接種部位局部變化、呼吸、體溫和食欲等臨床指標(biāo)[14]。

1.5 滅活苗免疫仔豬的抗體水平測(cè)定

選5頭HPS抗體陰性的14日齡仔豬，每頭豬頸部肌肉注射2 mL滅活苗，3周后二免；分別在首免后第 7、14、28、56、84、112、140、168、196 天采血，用ELISA試劑盒檢測(cè)仔豬HPS抗體水平[15]。

1.6 小白鼠半數(shù)致死量測(cè)定

MC-203株和XJ-103株于TSB培養(yǎng)基中復(fù)蘇，劃線接種于TSA中連續(xù)傳代，挑單菌落接種于TSB中，37 ℃培養(yǎng) 12 h，收集菌液。參照寇氏法（Korbor），首先對(duì)這兩株菌株進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置5個(gè)劑量組，每個(gè)劑量組的菌液7 000 g/min離心10 min，用0.5 mL PBS重懸備用。選擇17～19 g健康昆明小白鼠72只，雌雄各半，平均分為12組，每個(gè)菌株設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，1個(gè)對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組每只小白鼠經(jīng)腹腔注射0.5 mL菌液，對(duì)照組每只小白鼠經(jīng)腹腔注射0.5 mL PBS。觀察并記錄各劑量組小白鼠的死亡數(shù)和死亡率，連續(xù)觀察7 d，計(jì)算各菌株的LD50。

1.7 仔豬毒力實(shí)驗(yàn)

MC-203株和XJ-103株于TSB培養(yǎng)基中復(fù)蘇，劃線接種于TSA中連續(xù)傳代，挑單菌落接種于TSB中，37℃培養(yǎng)12 h，收集菌液。取培養(yǎng)好的菌液按各菌株的5×LD50的劑量[2]腹腔注射5頭35日齡斷奶仔豬（菌液離心后，用3 mL PBS重懸）。同時(shí)每個(gè)菌株設(shè)立5只仔豬腹腔注射無(wú)菌PBS作為對(duì)照（3 mL/頭）[16]。觀察和記錄仔豬發(fā)病及死亡情況至10 d，死亡者立即解剖，取其內(nèi)臟進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定。

1.8 滅活苗免疫仔豬的保護(hù)效力

將40頭35日斷奶齡仔豬隨機(jī)分為4組，每組10頭。Ⅰ組免疫本實(shí)驗(yàn)制備的HPS二價(jià)滅活苗、Ⅱ組免疫進(jìn)口商品苗，Ⅲ組免疫國(guó)產(chǎn)商品苗，Ⅳ組為PBS對(duì)照組。頸部肌肉注射，首免后間隔3周進(jìn)行二免[17-20]。二免2周后，分別用MC-203株和XJ-103株以5×LD50的劑量對(duì)每頭仔豬經(jīng)腹腔攻毒3 mL菌液[16]；觀察豬的臨床情況，持續(xù)14 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 二價(jià)苗無(wú)菌性檢驗(yàn)

二價(jià)滅活苗的制備當(dāng)菌液滅活到18 h時(shí)，菌液中還有少量的活菌；當(dāng)滅活到20 h時(shí)，細(xì)菌被完全滅活。因此，制備該二價(jià)滅活苗的最優(yōu)滅活時(shí)間是20 h。經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)，制備的疫苗在TSA培養(yǎng)基上無(wú)任何微生物生長(zhǎng)。

2.2 滅活苗的安全性檢驗(yàn)

該HPS二價(jià)滅活苗免疫仔豬后的臨床表現(xiàn)均正常。結(jié)果如表1所示。

表1 制備的HPS二價(jià)滅活苗對(duì)14日齡和35日齡仔豬接種的安全性檢驗(yàn)（n=5）Table1 The safety test of the candidate bivalent inactivated vaccine on 14-day and 35-day piglets（n=5）

2.3 滅活苗免疫仔豬后抗體水平

首免14 d后，免疫組實(shí)驗(yàn)豬血清中可檢測(cè)到特異性HPS抗體，免疫后抗體水平逐漸升高，并在第84 d達(dá)到峰值；之后抗體水平逐漸下降，在免疫后196 d仍然可以檢測(cè)到HPS抗體。結(jié)果如表2所示。

表2 滅活苗免疫仔豬后不同時(shí)間特異性HPS抗體的OD450 nm及抗體水平結(jié)果Table2 The specific antibody against HPS of piglets at different time(d)and antibody level after inactivation vaccine inoculated

2.4 小鼠半數(shù)致死量測(cè)定

根據(jù)各組小白鼠的感染數(shù)和死亡數(shù)計(jì)算各劑量組的劑量對(duì)數(shù)和動(dòng)物死亡百分率，LD50的計(jì)算公式 logLD50=∑1/2×（Xi+Xi+1）（Pi+1-Pi），其中 Xi與 Xi+1及Pi與Pi+1分別為相鄰兩組的劑量對(duì)數(shù)及動(dòng)物死亡百分率。得出血清5型HPS分離株MC-203株的LD50為1.36×109CFU；血清13型HPS分離株XJ-103株的LD50為1.62×109CFU。結(jié)果如表3所示。

表3 MC-203株和XJ-103株的半數(shù)致死量測(cè)定結(jié)果Table3 Determination of 50%lethal dose of MC-203 and XJ-103 strains

2.5 仔豬毒力實(shí)驗(yàn)

6.8×109CFU的MC-203株的菌液和8.1×109CFU的XJ-103株的菌液接種的所有仔豬在70 h內(nèi)全部死亡，剖檢可見(jiàn)副豬嗜血桿菌病的典型病變（表4）。

表4 MC-203株和XJ-103株的仔豬攻毒實(shí)驗(yàn)Table4 Piglets challenging experiment with MC-203 and XJ-103

2.6 滅活疫苗免疫仔豬的保護(hù)效力

3種疫苗免疫仔豬后，用6.8×109CFU的MC-203株的菌液攻毒，自制二價(jià)滅活疫苗的保護(hù)率為80%，進(jìn)口商品疫苗的保護(hù)率為80%，國(guó)產(chǎn)商品疫苗的保護(hù)率為60%（表5）。

表5 3種HPS疫苗二免35日齡仔豬2周后MC-203株菌液攻毒結(jié)果Table5 Protective rate of the 35-day pigs challenged with strain MC-203 of 2 weeks booster immunized with 3 kinds of HPS vaccines

3種滅活苗免疫仔豬后，用8.1×109CFU的XJ-103株的菌液攻毒，自制二價(jià)滅活苗的保護(hù)率為80%，進(jìn)口商品疫苗的保護(hù)率為80%，國(guó)產(chǎn)商品疫苗的保護(hù)率為60%（表6）。

表6 3種HPS疫苗二免35日齡仔豬2周后XJ-103株菌液攻毒結(jié)果Table6 Protective rate of the 35-day pigs challenged with strain XJ-103 of 2 weeks booster immunized with 3 kinds of HPS vaccines

綜合表4和表5可知，用血清5型MC-203株和血清13型XJ-103株攻毒后，自制二價(jià)滅活苗的總保護(hù)率為80%，進(jìn)口商品疫苗的總保護(hù)率為80%，國(guó)產(chǎn)商品疫苗的總保護(hù)率為60%。

3 討論與結(jié)論

副豬嗜血桿菌病是當(dāng)今危害養(yǎng)豬業(yè)較嚴(yán)重的一種細(xì)菌性傳染病，尤其是當(dāng)HPS與其他病原混合感染時(shí)危害更加嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前主要是通過(guò)抗生素治療本病，但隨著菌株耐藥性的問(wèn)題日趨嚴(yán)重，致使治療效果大打折扣，因此依靠疫苗防控是行之有效的方法。HPS血清型4型和5型滅活疫苗是我國(guó)施用的主要商品苗，其可以降低針對(duì)相應(yīng)血清型病原造成的副豬嗜血桿菌病的死亡率和臨床癥狀[21]，但由于HPS具有很強(qiáng)的地方性特征，O.P.Miniats等[8]研究結(jié)果表明，不同血清型的菌株間缺乏交叉保護(hù)，若商品疫苗菌株和致病菌株的血清型不同，會(huì)導(dǎo)致免疫失??；兩株高毒力菌株所制備的疫苗誘發(fā)了可以同時(shí)抵抗同源和異源攻毒的交叉保護(hù)；兩株低毒力菌株所制備的菌苗只能抵抗同源攻毒。因此本試驗(yàn)研制的疫苗采用了四川地區(qū)流行的免疫原性良好的兩株高毒力HPS。

本試驗(yàn)采用14和35日齡的仔豬，并對(duì)其安全性進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)制備的HPS二價(jià)滅活苗免疫仔豬安全性高。從免疫后抗體效價(jià)消長(zhǎng)規(guī)律可以看出該二價(jià)滅活苗可以使豬群產(chǎn)生較高水平的抗體，且維持較長(zhǎng)時(shí)間。免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果（表5和表6）顯示攻毒后本實(shí)驗(yàn)制備的二價(jià)滅活苗組和進(jìn)口商品疫苗組共20頭豬全部存活，國(guó)產(chǎn)商品疫苗組死亡2頭，而對(duì)照組的10頭豬全部死亡，表明本研究所制備的二價(jià)滅活苗和進(jìn)口商品疫苗保護(hù)率相當(dāng)，而國(guó)產(chǎn)商品疫苗對(duì)豬的保護(hù)率要低一些。這一結(jié)果驗(yàn)證了A.Fuente等[22]的觀點(diǎn)，證明HPS滅活疫苗可以有效地控制與制備疫苗相同血清型的細(xì)菌的感染。綜上所述，本研究選用四川地區(qū)流行的HPS制備出二價(jià)滅活疫苗，通過(guò)仔豬安全性試驗(yàn)、免疫后抗體水平監(jiān)測(cè)及攻毒保護(hù)試驗(yàn)等，表明本滅活疫苗安全性高，有較好的免疫原性，對(duì)仔豬的免疫保護(hù)效力高，能有效預(yù)防對(duì)應(yīng)血清型菌株造成的副豬嗜血桿菌病的發(fā)生，且滅活疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，無(wú)排毒散毒危險(xiǎn)，這為副豬嗜血桿菌病疫苗的研制和本病的防控提供了參考。