林 鷙,何錫忠,李本強(qiáng),潘 潔,朱永軍,趙本進(jìn),彭麗英

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106)

豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的急性傳染病,臨床特征為動(dòng)物發(fā)熱、奇癢及繁殖障礙等。目前,該病尚無(wú)有效的治療藥物,疫苗免疫是預(yù)防該病的主要途徑。2011年以來(lái),一種由偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病在我國(guó)爆發(fā),主要造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡[1-3]。而接種傳統(tǒng)的偽狂犬病疫苗已不能完全保護(hù)偽狂犬病毒變異毒株的侵襲。

PRV gE基因全長(zhǎng)1 740 bp,其N端包含機(jī)體免疫系統(tǒng)能識(shí)別的主要靶抗原。gE是PRV復(fù)制的非必需基因,已經(jīng)有研究表明,gE的缺失能降低病毒的嗜神經(jīng)性且不影響其免疫原性[4]。

目前,針對(duì)病毒基因改造主要是通過(guò)同源重組、細(xì)菌人工染色體等技術(shù)來(lái)進(jìn)行的。CRISPR∕Cas9是最新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)的Cas9核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行編輯的技術(shù),Cas9蛋白在序列靶定位點(diǎn)切斷雙鏈DNA,然后再通過(guò)非同源重組末端連接和同源重組的方式對(duì)斷鏈DNA進(jìn)行修復(fù)。已有研究表明,CRISPER∕Cas9系統(tǒng)能夠編輯人皰疹病毒的基因組[5]。

本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建針對(duì)PRV gE基因的Cas9∕gRNA載體,對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離得到的變異毒株P(guān)RV-SX株進(jìn)行編輯,并通過(guò)蝕斑純化方法篩選得到突變毒株并對(duì)突變毒株的免疫效果進(jìn)行研究,以期為后續(xù)的基因缺失滅活疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種毒、細(xì)胞

豬偽狂犬病毒PRV-SX株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離所得。ST細(xì)胞由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 試驗(yàn)試劑及耗材

豬偽狂犬病毒gB和gE抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司。胎牛血清、胰酶和DMEN為Invitrogen公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)耗材購(gòu)自上海生工生物科技有限公司。病毒基因組DNA∕RNA提取試劑盒(DP315)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。Cas9∕gRNA構(gòu)建試劑盒(VK001-02)、gRNA靶點(diǎn)效率試劑盒(VK007)、T7E1核酸酶均購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1gE基因Cas9∕gRNAs載體的構(gòu)建

利用在線gRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站(http：∕∕crispr.mit.edu∕)設(shè)計(jì)4對(duì)針對(duì)PRV gE基因的gRNAs。利用商品化的CRISPR∕Cas9構(gòu)建試劑盒構(gòu)建同時(shí)表達(dá)Cas9和gRNA的Cas9∕gRNA載體。

1.2.2 病毒基因組的提取

取200 μL病毒懸液于1.5 mL離心管中,反復(fù)凍融3次,按照病毒基因組DNA∕RNA提取試劑盒(DP315)說(shuō)明書提取病毒DNA。

1.2.3 T7E1酶切試驗(yàn)

設(shè)計(jì)1對(duì)能擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)的DNA片段(F：CACCATCGCAGAGGAACAATA;R：TTGTGGGTCATCACGAGCAC),將擴(kuò)增得到的野生型和突變型PCR產(chǎn)物混合后進(jìn)行加熱沸騰使其變性,自然冷卻至室溫復(fù)性,復(fù)性完成后加入0.5 μL T7E1酶,混勻后37℃反應(yīng)30 min,65℃滅活,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 測(cè)序分析

將得到的PCR產(chǎn)物膠回收后,送上海生工生物工程有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果與野生型PRV gE基因比對(duì),明確PRV gE基因中的突變位置和突變類型。

1.2.5 偽狂犬病滅活疫苗制備

將PRV gE基因缺失毒株接種ST細(xì)胞,細(xì)胞病變達(dá)90%時(shí)收獲,測(cè)得TCID50∕mL達(dá)108.0,經(jīng)甲醛滅活后與206佐劑按1∶1的比例配制,保存于2—8℃冰箱中待用。

1.2.6 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

于南京某豬場(chǎng)購(gòu)10頭21日齡的PRV抗體陰性的三元豬仔豬。將仔豬隨機(jī)分成2組,第一組接種偽狂犬病滅活疫苗,每頭2 mL;第二組每頭接種2 mL PBS溶液作為對(duì)照。免疫28 d后加強(qiáng)免疫1次,分別采取免疫后0 d、14 d、28 d、42 d、56 d的血清,檢測(cè)血清中g(shù)B和gE抗體水平。

圖1 Cas9∕gRNA的活性檢測(cè)Fig.1 Activity detection of Cas9∕gRNA

2 結(jié)果與分析

2.1 Cas9∕gRNAs-gE 載體構(gòu)建

對(duì)合成好的Cas9∕gRNA進(jìn)行活性檢測(cè),與標(biāo)準(zhǔn)品1和標(biāo)準(zhǔn)品2進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示(圖1)：gRNA1的酶切效率為50%(第1泳道),gRNA2酶切效率為80%(第2泳道),gRNA3酶切效率為60%(第3泳道),gRNA4酶切效率為95%(第4泳道)。選用活性較高的gRNA靶點(diǎn)(gRNA2和gRNA4)進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞試驗(yàn)。

2.2 突變毒株的純化

T7E1核酸酶能夠識(shí)別錯(cuò)配的雜合雙鏈并進(jìn)行剪切。為了得到突變的毒株,轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的Cas9∕gRNAs-gE入ST細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后接種PRV,待細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時(shí)收集上清及細(xì)胞,提取病毒DNA,如圖2第3泳道結(jié)果所示,PCR擴(kuò)增出帶有突變位點(diǎn)DNA片段,長(zhǎng)度1 204 bp,退火經(jīng)T7E1酶切后出現(xiàn)800 bp和400 bp的兩條突變型條帶,說(shuō)明該毒株含有突變。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行蝕斑純化,篩選得到純的突變毒株,如圖3中第3泳道和第4泳道所示,T7E1酶切鑒定得到純的突變毒株。以上結(jié)果表明,應(yīng)用CRISPER∕Cas9編輯得到了突變毒株。

圖2 T7E1酶切鑒定突變毒株Fig.2 Identification of mutant strains by T7E1 enzyme digestion

圖3 T7E1酶切鑒定純化后的突變毒株Fig.3 Identification of purified mutant strains by T7E1 enzyme digestion

圖4 測(cè)序結(jié)果Fig.4 Sequencing results

2.3 測(cè)序分析

為驗(yàn)證突變的具體位置及突變類型,對(duì)純化后的突變毒株的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示得到了1株突變毒株,在設(shè)計(jì)位點(diǎn)上缺失了AG兩個(gè)堿基,從而造成了閱讀框的移碼突變(圖4)。

2.4 動(dòng)物免疫試驗(yàn)

PRV gB抗體檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5A)：免疫組免疫14 d后gB抗體均呈陽(yáng)性,并在免疫42 d后達(dá)到強(qiáng)陽(yáng)性,S∕N值小于0.05且離散度小;對(duì)照組gB抗體均為陰性。全部試驗(yàn)豬PRV gE抗體在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程均呈陰性(圖5B)。

圖5 免疫豬PRV特異性抗體變化Fig.5 PRV specific antibody responses in piglets

3 討論

近年來(lái),一種由偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病在我國(guó)爆發(fā),給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)許多學(xué)者對(duì)新流行的PRV毒株的基因特征、免疫原性等進(jìn)行了一系列的研究,并且開展了疫苗的研制工作。Wang等[6]通過(guò)同源重組技術(shù)構(gòu)建了PRV TJ株的gE缺失突變株,6周齡的仔豬免疫該毒株后可以完全抵擋TJ株的致死性攻擊。Gu等[7]利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)(BAC),Tong等[8]利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了PRV gI∕gE雙缺失突變毒株,后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明以該毒株制備的疫苗具有良好的免疫保護(hù)效果。此外,也有學(xué)者分別通過(guò)細(xì)菌人工染色體技術(shù)(BAC)、同源重組技術(shù)構(gòu)建了PRV TK∕gI∕gE三缺失突變株,也評(píng)價(jià)了該毒株對(duì)仔豬的免疫保護(hù)效果[9-11]。同源重組是一種經(jīng)典的編輯手段,但是存在重組概率低,操作復(fù)雜等難題,因此本研究通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)PRV gE基因的gRNA,利用CRISPR∕Cas9編輯系統(tǒng)成功編輯了PRV gE基因,利用蝕斑純化得到了一株gE基因缺失的突變毒株,T7E1核酸酶酶切鑒定正確,測(cè)序發(fā)現(xiàn)在設(shè)計(jì)位點(diǎn)上缺失了CT兩個(gè)堿基,造成了閱讀框的移碼突變。隨后將該毒株制成疫苗免疫了21日齡的仔豬,監(jiān)測(cè)免疫后不同時(shí)間點(diǎn)的PRVgE和gB糖蛋白的特異性抗體,結(jié)果顯示該毒株免疫效果很好。這些數(shù)據(jù)表明通過(guò)CRISPR∕Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的基因缺失突變毒株的免疫效果與其他科學(xué)家通過(guò)傳統(tǒng)方法構(gòu)建的突變毒株免疫效果相當(dāng)。

本研究表明,運(yùn)用特定的gRNA,CRISPR∕Cas9系統(tǒng)能夠編輯PRV基因組,通過(guò)缺失堿基最終導(dǎo)致基因的移碼突變,由此可見對(duì)于難以操作的大型DNA病毒來(lái)說(shuō),CRISPR∕Cas9系統(tǒng)是一個(gè)重要的編輯工具。此外,本研究構(gòu)建的gE基因缺失毒株具有良好的免疫原性且免疫后不產(chǎn)生針對(duì)gE糖蛋白的抗體,可以用來(lái)區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物和野毒感染動(dòng)物。因此,該毒株可作為PRV疫苗候選毒株用于防控PRV。