何金華 周紅霞 顧影影 李明凱* 王愛民 朱永元

（1 江蘇省濱海中學(xué) 江蘇濱海 224500 2 江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇徐州 221116 3 濱?？h人民醫(yī)院 江蘇濱海 224500）

活性染色是指利用某些無毒或毒性較小的染色劑顯示細(xì)胞內(nèi)某些天然構(gòu)造存在的真實(shí)性，而不影響細(xì)胞的生命活動(dòng)和產(chǎn)生任何物理化學(xué)變化以致細(xì)胞死亡的一種染色方法［1］。活性染色按染色途徑和方法可分為體外活性染色和體內(nèi)活性染色，用健那綠染色線粒體屬于體外染色，以臺(tái)盼藍(lán)或者墨汁注入動(dòng)物腹腔研究吞噬細(xì)胞則屬于體內(nèi)染色。

對細(xì)胞、 細(xì)胞器或其他物質(zhì)染色的目的是為了對所染色對象進(jìn)行結(jié)構(gòu)和代謝方面的觀察。在眾多的染料中，高中生物學(xué)所涉及的活性染料有3 種，分別是健那綠、亞甲基藍(lán)和臺(tái)盼藍(lán)，目前高中生物學(xué)教學(xué)中對健那綠染料的實(shí)驗(yàn)過程分析較深入，但對健那綠如何進(jìn)入細(xì)胞染色出現(xiàn)較多的爭議，現(xiàn)從活性染料健那綠的化學(xué)本質(zhì)、 染色機(jī)理、運(yùn)輸方式及試劑配制4 個(gè)方面進(jìn)行綜合分析。

1 化學(xué)本質(zhì)

1.1 化學(xué)結(jié)構(gòu) 健那綠，別稱詹納斯綠、 鐵蘇木精，分子式C30H31ClN6，為具有吩嗪結(jié)構(gòu)的堿性染料。吩嗪結(jié)構(gòu)具有難溶于水、微溶于乙醇等有機(jī)物質(zhì)，固態(tài)成針狀晶體，顏色為近乎無色等特征。從結(jié)構(gòu)式分析，健那綠中含有4 種基本基團(tuán)，分別為二甲基胺 （氫原子被取代后認(rèn)為含叔胺）、 二乙基胺（氫原子被取代后認(rèn)為含叔胺）、 苯環(huán)和吩嗪結(jié)構(gòu)（含仲胺、季胺）（圖1）。從整體結(jié)構(gòu)上看，由于該結(jié)構(gòu)屬于氯化物的鹽類，因此可溶于水，但水解后產(chǎn)生的陽離子基團(tuán)因攜帶3 種結(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)不同的溶解性質(zhì)，所以該物質(zhì)最終表現(xiàn)的化學(xué)性質(zhì)為溶于水還是溶于有機(jī)溶劑時(shí)必須將其一分為二進(jìn)行分析。

圖1 3 種N 中心原子的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.2 化學(xué)性質(zhì)

1.2.1 吩嗪結(jié)構(gòu)的化學(xué)性質(zhì) 在化學(xué)上，吩嗪及其衍生物是重要的精細(xì)化工的原料，在人類的生產(chǎn)生活中具有廣泛的應(yīng)用［2］，例如目前很多菌種分泌的吩嗪結(jié)構(gòu)物質(zhì)可以作為有效的殺菌藥物。

從吩嗪結(jié)構(gòu)基團(tuán)的極性角度看，吩嗪結(jié)構(gòu)為典型的呈正六邊形的非極性結(jié)構(gòu)；從陽離子基團(tuán)的極性角度看，由于健那綠左右兩側(cè)的結(jié)構(gòu)基團(tuán)不一致，其電荷中心不能重合，因此整個(gè)陽離子基團(tuán)是極性結(jié)構(gòu)。從化學(xué)“相似相容”的一般原理分析，極性分子應(yīng)與極性分子互相溶解，非極性分子應(yīng)與非極性分子溶解，可以知道，水解后的健那綠的陽離子基團(tuán)可溶于水而微溶于有機(jī)溶劑。但在某些情況下，分子的溶解性并不僅僅取決于其極性及極性的大小，應(yīng)更多地看其分子結(jié)構(gòu)是否相似。

吩嗪結(jié)構(gòu)為具有3 個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的有機(jī)物，不具備羥基，其結(jié)構(gòu)與水的結(jié)構(gòu)完全不同，因此，雖然兩者都有極性，但在溶解度上卻是不相溶的，或者說吩嗪結(jié)構(gòu)在水中的溶解度極低，即難溶于水。

1.2.2 有機(jī)胺結(jié)構(gòu)的化學(xué)性質(zhì) 有機(jī)胺種類多樣、結(jié)構(gòu)多種，具有較為極端的生理性質(zhì)，如致癌等。健那綠陽離子基團(tuán)中的有機(jī)胺分別為二甲基胺（1）、二乙基胺（2）、仲胺（3）、季胺（4）4 種，具體結(jié)構(gòu)如圖所示：

圖2 4 種有機(jī)胺

在有機(jī)化學(xué)中，伯、仲、叔胺都能與水分子形成氫鍵，因此低級(jí)胺易溶于水，胺的溶解度隨分子量的增加而迅速降低，從6 個(gè)碳原子的胺開始就難溶于水，而一般可溶于醇、苯等有機(jī)溶劑［3］。從健那綠的拆分結(jié)構(gòu)看，除了季胺不易溶于水外，其余3 個(gè)有機(jī)胺均可溶于水；從整體分子結(jié)構(gòu)看，其碳原子的總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于6 個(gè)，不易溶于水。

1.2.3 甲基的化學(xué)性質(zhì) 在藥物化學(xué)中，甲基的應(yīng)用非常廣泛，可用于合成特殊性質(zhì)的有機(jī)物。有研究表明，在藥物分子中引進(jìn)甲基，能夠增加化合物的脂溶性，進(jìn)而提高透過生物膜的能力［4］。在健那綠分子中，具有多個(gè)甲基基團(tuán)，在一定程度上增加了其脂溶性。

綜上所述，對健那綠分子的陽離子基團(tuán)而言，其溶于水的能力較弱，而可以溶于有機(jī)溶劑。

2 染色機(jī)理

2.1 基本原理 健那綠是對線粒體具有專一性染色且毒性最少的一種堿性染料，其基本原理是由于線粒體中細(xì)胞色素氧化酶系的作用，使染料始終保持氧化狀態(tài)而保持藍(lán)綠色，而細(xì)胞質(zhì)則被還原為無色。因此，健那綠不僅可以用于進(jìn)行線粒體的觀察，也可以用于區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞膜上有氧化酶，所以細(xì)菌也可以被健那綠B 染成藍(lán)綠色［5］。當(dāng)然，雖然健那綠是活性染料，但是對染色時(shí)間也是有要求的。有研究表明，人口腔上皮細(xì)胞一般染色20 min 左右，時(shí)間稍長或稍短沒有明顯影響［6］，但時(shí)間過長（約1 h）后，細(xì)胞會(huì)死亡而影響實(shí)驗(yàn)的觀察。

2.2 線粒體的染色原因 從前面的原理分析中得知，健那綠能夠染色線粒體的主要原因在于線粒體膜具有氧化酶，能夠使甲基綠保持氧化狀態(tài)而呈現(xiàn)藍(lán)綠色。但問題的關(guān)鍵在于為什么染料能夠進(jìn)入線粒體而不在于為什么呈現(xiàn)藍(lán)綠色。

解決這個(gè)問題的關(guān)鍵在于要了解染料的電化學(xué)的特性。從上述分析中得知，健那綠水解后帶有顏色的部分是陽離子基團(tuán)而不是陰離子（Cl-），陽離子基團(tuán)更容易和陰離子基團(tuán)結(jié)合。

第1，線粒體膜具有氧化酶系。由于質(zhì)子泵的存在，使得線粒體膜間隙聚集了大量的陽離子，即呈現(xiàn)正電荷，而線粒體基質(zhì)則由于聚集了大量的陰離子，即呈現(xiàn)負(fù)電荷。因此，線粒體基質(zhì)可以有效吸引呈現(xiàn)正電荷的健那綠陽離子基團(tuán)。第2，有研究表明，線粒體外膜通透性較高，允許分子量在15 kD 以下的分子通過，而內(nèi)部則不允許分子量大于1.5 kD 的分子通過［7］，因此，分子量為511Da的健那綠可以通過外膜和內(nèi)膜進(jìn)入線粒體基質(zhì)。第3，在線粒體的內(nèi)、外膜之間還存在著“孔蛋白”的離子通道或離子轉(zhuǎn)運(yùn)體［8］，也有可能對健那綠物質(zhì)的運(yùn)輸具有輔助作用。綜上所述，在陰、陽離子的相互吸引及可能的孔蛋白的幫助下，健那綠的陽離子基團(tuán)可以進(jìn)入線粒體被氧化而呈現(xiàn)藍(lán)綠色。

3 健那綠進(jìn)入細(xì)胞的運(yùn)輸方式

3.1 健那綠進(jìn)入細(xì)胞的運(yùn)輸方式的問題 在染色過程中，健那綠可以進(jìn)入細(xì)胞中的線粒體，使得線粒體著色成藍(lán)綠色。有教師認(rèn)為，健那綠進(jìn)入細(xì)胞中的運(yùn)輸方式為胞吞或者主動(dòng)運(yùn)輸，原因在于實(shí)驗(yàn)過程中需要用到生理鹽水，所以其可溶于水，因而是親水性而非脂溶性的物質(zhì)；也有教師認(rèn)為，健那綠進(jìn)入細(xì)胞的運(yùn)輸方式為自由擴(kuò)散，原因在于其結(jié)構(gòu)中具有吩嗪結(jié)構(gòu)，因此是脂溶性的，可以通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞中。

3.2 健那綠進(jìn)入細(xì)胞的運(yùn)輸方式的分析 上述2 種觀點(diǎn)的爭論在于沒有了解健那綠的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其性質(zhì)導(dǎo)致的。從前面關(guān)于健那綠的結(jié)構(gòu)和形式的描述中得知，在溶于水的主要原因在于健那綠是氯化物的鹽類，其水解后的陽離子基團(tuán)很難溶于水。

在了解上述問題的基礎(chǔ)上，對甲基綠進(jìn)入細(xì)胞的方式進(jìn)行分析。從生理學(xué)角度講，甲基綠相較于細(xì)胞來說是外界物質(zhì)，且其具有一定的毒性（活性染料一般是經(jīng)稀釋后低毒或無毒，并不是本身就低毒或無毒），因此細(xì)胞不能主動(dòng)吸收該物質(zhì)，即不會(huì)通過胞吞或主動(dòng)運(yùn)輸吸收； 從化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)角度講，甲基綠水解后的陽離子具有脂溶性，可以擴(kuò)散通過細(xì)胞膜。因此，陽離子進(jìn)入細(xì)胞中的方式是自由擴(kuò)散。

所以，進(jìn)入細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)應(yīng)該是健那綠水解后的陽離子基團(tuán)而非健那綠的整個(gè)結(jié)構(gòu)，且陽離子脂溶性使得可以通過擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞。

3.3 “箭頭模型”假說 “箭頭模型”假說形象化了健那綠的分子結(jié)構(gòu)，更為直觀的闡述其通過膜的方式。該模型中，以吩嗪結(jié)構(gòu)作為“箭頭”，以“二甲基胺和二乙基胺”作為“兩翼”，共同構(gòu)成完整的“箭頭模型”，具體模型如圖3所示。

圖3 健那綠運(yùn)輸?shù)摹凹^模型”

吩嗪結(jié)構(gòu)的脂溶性下，陽離子自由擴(kuò)散通過膜結(jié)構(gòu)，其兩翼的二甲基胺和二乙基胺逐次依次通過，剩下的苯環(huán)結(jié)構(gòu)最終通過膜。

4 配制健那綠溶液時(shí)的問題

1）為什么要加入生理鹽水而不是蒸餾水或純凈水。

生理鹽水，即與人體內(nèi)環(huán)境濃度基本相當(dāng)?shù)臒o菌鹽水，其基本作用在于維持細(xì)胞滲透壓，防止發(fā)生吸水漲破。在實(shí)驗(yàn)中，一般所使用的材料為人口腔上皮細(xì)胞的線粒體，因此用生理鹽水有助于保持細(xì)胞的活性。一般而言，在實(shí)驗(yàn)操作中的線粒體的活性保持時(shí)間約為1 h。

如果在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)加入蒸餾水或純凈水，雖然后續(xù)制片過程中也有生理鹽水，但因在添加染料時(shí)會(huì)重復(fù)多次操作，很明顯，這樣操作會(huì)降低生理鹽水的濃度，有可能使細(xì)胞吸水漲破，所以不能加入蒸餾水或純凈水。

2）為什么不將健那綠溶解到有機(jī)溶劑再進(jìn)行染色。

第1，由于大多數(shù)的有機(jī)溶劑是有毒的，對細(xì)胞具有毒害作用，容易通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致毒害的發(fā)生，而且即使沒有毒害的發(fā)生，也會(huì)和脂溶性的健那綠發(fā)生類似于群落中的“種間競爭”關(guān)系而導(dǎo)致染色效果不好，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)要盡可能不用有機(jī)溶劑。

第2，在健那綠的單質(zhì)中，需要的是經(jīng)過解離后的陽離子基團(tuán)，而非整個(gè)健那綠單質(zhì)，因?yàn)槿绻墙∧蔷G的單質(zhì)，則不能通過陰陽離子的結(jié)合附著在線粒體膜上（前面已經(jīng)敘述），因此，需要用水進(jìn)行解離獲得陽離子基團(tuán)。

3）為什么要加熱。健那綠要溶解在生理鹽水中使用，而實(shí)際操作中，它的溶解度并不大，溶解速度也非常緩慢，所以要對溶液加熱使得健那綠燃料能夠快速、充分地溶解在生理鹽水中。溫度超過50℃，健那綠就可能發(fā)生水解導(dǎo)致不能染色，所以推薦加熱溫度30～40℃。這同時(shí)也是大多數(shù)生物的體溫。使用30～40℃的染料對活細(xì)胞進(jìn)行染色，也有助于提高細(xì)胞代謝水平，加快染色進(jìn)度。加熱的步驟事實(shí)上也驗(yàn)證了前面所說的健那綠的水解與脂溶性的問題。

5 其他問題

在藥代動(dòng)力學(xué)中，還有分子極性表面積與藥物吸收之間的關(guān)系。通過分析有機(jī)分子的極性表面積可以預(yù)測該物質(zhì)能否通過細(xì)胞膜及通過細(xì)胞膜與物質(zhì)濃度之間的線性或者非線性的關(guān)系，也不失為探討本文問題的方法之一。