周清武

中圖分類號 R917；R979.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）08-1078-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.08.16

摘 要 目的：探討酶放大免疫測定技術(shù)（EMIT）檢測環(huán)孢素血藥濃度的動態(tài)飄逸校正系數(shù)。方法：針對EMIT法檢測環(huán)孢素藥物濃度的動態(tài)飄逸現(xiàn)象，以質(zhì)量濃度為100 ng/mL的環(huán)孢素定標(biāo)液為待測樣品，選擇其第58、101次檢測結(jié)果來進(jìn)行動態(tài)飄逸相關(guān)系數(shù)的推擬；分別以上述系數(shù)對第1、20、45、77、106、115次檢測結(jié)果進(jìn)行校正，考察校正質(zhì)量濃度與真實質(zhì)量濃度的差異。結(jié)果：推擬得動態(tài)飄逸系數(shù)k=（1+0.001 235×n0.419 5）n，動態(tài)飄逸校正系數(shù)k′ =1/[（1+0.001 235×n0.419 5）n]。各次檢測結(jié)果經(jīng)校正后，其校正質(zhì)量濃度與真實質(zhì)量濃度的相對誤差在±4%之內(nèi)。結(jié)論：推擬所得的動態(tài)飄逸校正系數(shù)可用于環(huán)孢素質(zhì)控樣品濃度的動態(tài)校正，有助于環(huán)孢素血藥濃度的準(zhǔn)確檢測。

關(guān)鍵詞 酶放大免疫測定技術(shù)；環(huán)孢素；血藥濃度；動態(tài)飄逸；校正系數(shù)

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the dynamic upwarp state correction coefficient of cyclosporine blood concentration determined by EMIT. METHODS： The dynamic upwarp state of cyclosporine concentration was determined by EMIT. The cyclosporine calibration reagents with concentration of 100 ng/mL was used as the sample to be measured， the 58th and 101st test results were selected to simulate the dynamic upwarp state related coefficients， and the 1st， 20th， 45th， 77th， 106th， 115th test results were corrected by above coefficients. The difference of correction quality concentration with real quality concentration was investigated. RESULTS： The dynamic upwarp state coefficient [k=（1+0.001 235×n0.419 5）n] and dynamic upwarp state correction coefficient {k′ =1/[（1+0.001 235×n0.419 5）n} were obtained. After determination results were corrected， relative error of corrected quality concentration with real quality concentration was within ±4%. CONCLUSIONS： The obtained dynamic upwarp state correction coefficient can be used for dynamic calibration of cyclosporine quality control concentration， which contribute to correct determination of blood concentration of cyclosporine.

KEYWORDS EMIT； Cyclosporine； Blood concentretion； Dynamic upwarp state； Correction coefficient

環(huán)孢素是臨床常用的免疫抑制劑之一，主用于肝、腎、骨髓等器官/組織移植以及再生障礙性貧血、腎病綜合征、干燥綜合征等異常免疫性疾病的治療[1-6]。由于環(huán)孢素的生物利用度及肝消除等個體差異大、治療窗窄，容易導(dǎo)致治療無效或中毒[7-8]，故需通過治療藥物監(jiān)測（Therapeutic drug monitoring，TDM）來指導(dǎo)其臨床個體化合理用藥。

酶放大免疫測定技術(shù)（Enzyme multiplied immunoassay technique， EMIT）是目前臨床TDM的主要手段之一，具有自動化程度高，可多品種、多樣本連續(xù)檢測，檢測時間短，樣品處理簡單，規(guī)律性強(qiáng)等特點，且當(dāng)試劑瓶中的試劑較多時，相鄰質(zhì)控樣品檢測的重現(xiàn)性較好[9]。但該法所用試劑昂貴，且當(dāng)試劑瓶中的試劑較少時，檢測結(jié)果會出現(xiàn)偏差，重現(xiàn)性較差[10-12]。上述偏差的規(guī)律性很強(qiáng)，呈現(xiàn)動態(tài)飄逸現(xiàn)象（即EMIT法檢測環(huán)孢素全血樣品時，隨著檢測次數(shù)的增加、試劑瓶中試劑的揮發(fā)，其質(zhì)控樣品的實測質(zhì)量濃度會持續(xù)向上飄逸，且試劑越少，飄逸值越大，特別是在批量檢測次數(shù)較少的試驗中尤為突出）[12]。過去常用多次定標(biāo)或質(zhì)控來糾正偏差，但必然會造成大量的試劑浪費，增加檢測成本。因此，為獲取準(zhǔn)確的環(huán)孢素血藥濃度檢測數(shù)據(jù)，本研究探討了EMIT法檢測人全血環(huán)孢素藥物濃度的動態(tài)飄逸相關(guān)系數(shù)，以動態(tài)校正環(huán)孢素實測質(zhì)量濃度，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

Viva-E型全自動生化儀（德國Siemens公司）；Vortex-5型漩渦混合器（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；Sorvall Legend Micro 21型高速臺式離心機(jī)（德國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

環(huán)孢素檢測試劑盒（包括環(huán)孢素抗體試劑A和酶試劑B，批號：6R079UL-J2、6R119UL-J2）、環(huán)孢素樣本預(yù)處理液（含硫酸銅、甲醇和乙二醇等蛋白沉淀劑，批號：6R719UL-J2）、環(huán)孢素定標(biāo)液（質(zhì)量濃度分別為0、50、100、200、350、500 ng/mL，批號：6R119UL-H2）；雷帕霉素/他克莫司/環(huán)孢素三合一質(zhì)控樣品（雷帕霉素與他克莫司的質(zhì)量濃度均為4.5、11、22 ng/mL，環(huán)孢素質(zhì)量濃度為80、200、350 ng/mL，批號：6019）均購自美國Siemens Healthcare Diagnostics公司。

1.3 全血樣品來源

全血樣品來自于我院行環(huán)孢素TDM的門診及住院患者。

2 方法與結(jié)果

2.1 全血樣品的處理

將環(huán)孢素全血樣品上下顛倒10～15次，輕搖混勻，靜置10 s，備用。依次精密吸取環(huán)孢素樣本預(yù)處理液300 μL和環(huán)孢素全血樣品100 μL，置于1.5 mL聚氯乙烯（PVC）離心管中，渦旋15 s后，靜置2 min，以離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速14 000 r/min離心2 min。精密吸取上清液約250 μL，置于2 mL PVC試管中，上機(jī)檢測。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取出貯存于2～8 ℃冰箱中的環(huán)孢素檢測試劑盒，置于26 ℃水浴中靜置5 min，平衡至室溫，按“2.1”項下方法處理環(huán)孢素定標(biāo)液，使用全自動生化儀檢測，按儀器操作規(guī)范進(jìn)行定標(biāo)。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、待測物血藥濃度（c）為橫坐標(biāo)，得環(huán)孢素回歸方程為A=0.271 692+0.080 597{1/[1+e（7.636 17-1.473 60lnc）]}。結(jié)果顯示，環(huán)孢素血藥濃度檢測線性范圍為40～500 ng/mL。

2.2.2 精密度和準(zhǔn)確度試驗 分別取低、中、高質(zhì)量濃度（80、200、350 ng/mL）的環(huán)孢素質(zhì)控樣品各適量，按“2.1”項下方法處理后，進(jìn)樣分析。單日內(nèi)平行操作5次，連續(xù)測定5 d，考察精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，各質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間RSD均小于9%，相對誤差均低于3%，符合《中國藥典》對生物樣品定量分析的要求[13]，詳見表1。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取低、高質(zhì)量濃度（80、350 ng/mL）的環(huán)孢素質(zhì)控樣品各適量，在室溫條件下分別放置8、24 h后，按“2.1”項下方法處理，進(jìn)樣分析，考察其穩(wěn)定性（各質(zhì)量濃度平行操作5次）。結(jié)果顯示，各質(zhì)控樣品在室溫條件下放置8、24 h穩(wěn)定，相對誤差在±3%以內(nèi)（RSD<7%，n=5），詳見表2。

2.3 動態(tài)飄逸現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)

筆者在采用EMIT法檢測環(huán)孢素血藥濃度的過程中發(fā)現(xiàn)，隨著檢測次數(shù)（n）的增加，試劑瓶中的試劑逐漸減少，質(zhì)控樣品的實測質(zhì)量濃度會逐漸升高，且初始升高的幅度較小，隨后幅度逐漸增大，呈現(xiàn)動態(tài)飄逸現(xiàn)象，具有非常穩(wěn)定的規(guī)律性，即“試劑瓶底效應(yīng)”[12，14]。故擬用恰當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)函數(shù)式來表示，以有助于獲取更為準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

2.4 動態(tài)飄逸相關(guān)系數(shù)的推擬

2.4.1 相關(guān)假設(shè)及公式推導(dǎo) 設(shè)定動態(tài)飄逸系數(shù)為k，得：

該式中，c測定為實測質(zhì)量濃度，c真實為真實質(zhì)量濃度（即標(biāo)示質(zhì)量濃度）。

設(shè)定每次實測質(zhì)量濃度與上次實測質(zhì)量濃度比較（首次檢測即為其實測結(jié)果與真實質(zhì)量濃度比較）增加的平均系數(shù)為a，那么第1次檢測的動態(tài)飄逸系數(shù)為（1+a），第2次檢測的動態(tài)飄逸系數(shù)為（1+a）2，第3次檢測的飄逸系數(shù)為（1+a）3，第n次檢測的動態(tài)飄逸系數(shù)為：

研究過程中發(fā)現(xiàn)，a值也同樣存在動態(tài)飄逸現(xiàn)象，且呈現(xiàn)出先小后大的上翹拋物線，可用指數(shù)函數(shù)來表示。設(shè)定指數(shù)函數(shù)的變量為n（即檢測次數(shù)），系數(shù)為b，指數(shù)為c，得a的指數(shù)函數(shù)為：

2.4.2 a、b、c值的計算 當(dāng)n值較小時，實測質(zhì)量濃度的飄逸值也較小，故本研究以真實質(zhì)量濃度為100 ng/mL的環(huán)孢素定標(biāo)液為待測樣品（環(huán)孢素有效治療濃度為100～200 ng/mL[7]），選擇其第58次和第101次的檢測結(jié)果（前期試驗顯示，當(dāng)n為50、100左右時，其k值突躍明顯且適中）來計算a、b、c值。其中，第58、101次的實測質(zhì)量濃度分別為c58=148.0 ng/mL，c101=236.5 ng/mL。由式③解得：a58=e[ln（148.0/100）/58]-1=0.006 78，a101=e[ln（236.5/100）/101]-1=0.008 56；由a58、a101、式④解得：b=0.001 235，c=0.419 5。

2.4.3 k的推擬 將b、c值代入式⑥，即得環(huán)孢素血藥濃度檢測的動態(tài)飄逸系數(shù)k=（1+0.001 235×n0.419 5）n。檢測次數(shù)（n）與動態(tài)飄逸系數(shù)（k）的關(guān)系圖見圖1。

2.4.4 k′ 的推擬 由式⑦可知，環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控檢測的動態(tài)飄逸校正系數(shù)k′ =1/[（1+0.001 235×n0.419 5）n]。

2.5 驗證試驗

以真實質(zhì)量濃度為100 ng/mL的環(huán)孢素定標(biāo)液作為待測樣品，以k′ 對其第1、20、45、77、106、115次檢測結(jié)果進(jìn)行校正。結(jié)果顯示，各校正質(zhì)量濃度與真實理論濃度的相對誤差在±4%之內(nèi)，詳見表3。

2.6 不同批次環(huán)孢素檢測試劑盒k與k′ 值的比較

以近期使用的2個不同批次的環(huán)孢素檢測試劑盒為研究對象，采用上述方法測定其k和k′ 。當(dāng)n=120時，得2個批次環(huán)孢素檢測試劑盒的k分別為3.002（k1）和3.223（k2），k′ 分別為0.333（k′ 1）、0.310（k′ 2）；采用上述2種檢測試劑盒檢測環(huán)孢素全血樣品得實測質(zhì)量濃度為300.2 ng/mL（n=120），分別經(jīng)k′ 1、k′ 2校正得校正質(zhì)量濃度分別為100.0、93.1 ng/mL，兩者的相對誤差為-6.90%，提示其差異較小。

3 討論

3.1 EMIT法標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程及注意事項

EMIT法為臨床環(huán)孢素TDM的常用方法之一。全血樣品中的環(huán)孢素與酶試劑中標(biāo)記的重組酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（rG6PDH）的環(huán)孢素發(fā)生競爭結(jié)合，有活性的rG6PDH將抗體試劑中的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸轉(zhuǎn)化為還原型，從而導(dǎo)致酶活性下降，引起吸光度的改變。EMIT法具有專屬性強(qiáng)、自動化程度高、可連續(xù)檢測、檢測時間短、樣品處理簡單等特點，其必要的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程及注意事項如下[9]：

3.1.1 儀器系統(tǒng) 定期清洗比色盤及進(jìn)樣針，可以減少比色盤的污染程度，減緩比色盤空白值的上升速度，棄用空白值偏差較大的比色杯；應(yīng)確保系統(tǒng)液體管路不漏氣，系統(tǒng)用純化水電導(dǎo)率<10 μS/cm；將新制純化水裝滿系統(tǒng)用水專用塑料桶后，立即加蓋密封，并靜置24 h以上以排盡桶內(nèi)空氣，從而降低微生物污染和生長的概率。

3.1.2 環(huán)境溫度、濕度 EMIT法檢測溫度要求在18～25 ℃內(nèi)，室溫變化對檢測結(jié)果會有較大影響[11，15]。因此，為減少溫度變化對檢測的影響，本研究將室溫控制在21～23 ℃內(nèi)波動，溫差<2 ℃，以減少溫度對檢測的不良影響[11-12]；將相對濕度保持在50%左右，以減少試劑揮發(fā)量的波動。

3.1.3 環(huán)孢素標(biāo)準(zhǔn)樣品的分裝 將環(huán)孢素定標(biāo)液和質(zhì)控品置于-20℃冰箱中貯存；使用前應(yīng)將其置于26 ℃水浴中靜置10 min，平衡至室溫，顛倒輕搖10～15次使之混勻，靜置10 s后，精密吸取100 μL至1.5 mL PVC管中，密封貯存于-20 ℃的冰箱中，并在有效期內(nèi)使用，以確保環(huán)孢素定標(biāo)液和質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度的穩(wěn)定。

3.1.4 環(huán)孢素檢測試劑盒 將環(huán)孢素檢測試劑盒放置于2～8 ℃冰箱中貯存；使用前將其置于26 ℃水浴中靜置5 min，平衡至室溫；檢測結(jié)束時，立即封蓋并放回冰箱中，盡量縮短室溫放置時間，以有助于保持試劑穩(wěn)定。

3.2 動態(tài)飄逸現(xiàn)象的原因分析

（1）單個樣品檢測需用時14 min；當(dāng)進(jìn)行多個樣品批量檢測時，每增加1個樣品，耗時需增加0.5 min。試劑瓶口內(nèi)徑為1.4 cm，且瓶底伴有冷風(fēng)（溫度：16.5 ℃）。隨著檢測時間的延長，試劑瓶中的溶劑揮發(fā)導(dǎo)致試劑濃縮，是引起EMIT法動態(tài)飄逸現(xiàn)象的根本原因。（2）由于臨床檢測需要，會對檢測試劑進(jìn)行分裝，因此多次出現(xiàn)“試劑瓶底效應(yīng)”，從而影響檢測結(jié)果，加速試劑揮發(fā)，造成動態(tài)飄逸現(xiàn)象。（3）檢測儀器同樣也會對檢測結(jié)果造成影響，現(xiàn)有儀器尚無法解決檢測過程中廣口試劑瓶溶劑揮發(fā)的問題，仍有待于生產(chǎn)廠商的進(jìn)一步研發(fā)。

3.3 檢測時長與批量檢測

由前期試驗可知，試劑揮發(fā)量與檢測時長有關(guān)。對于相同數(shù)量的待測樣品，批量檢測越多，所需檢測時長越短，試劑揮發(fā)量越少，動態(tài)飄逸系數(shù)則越小。本研究所用儀器的樣品盤中共51個樣本位，若使用環(huán)孢素檢測試劑盒測定120個全血樣本（額定檢測量），單獨檢測所需的最大時長為1 680 min；而批量檢測所需的最小時長僅為101 min，相當(dāng)于單獨檢測8次（n=8），由“2.4.3”項下公式計算可知，動態(tài)飄逸系數(shù)k8=1.024，比k0（k0=1）增加了2.4%，檢測偏差<3%。因此，筆者建議盡可能批量檢測，以有效縮短檢測時間及動態(tài)飄逸系數(shù)；此外，為減少試劑揮發(fā)，檢測完畢后應(yīng)盡快密封試劑瓶。

3.4 k與k′ 值的實際應(yīng)用價值

（1）使用k值，可預(yù)知環(huán)孢素實測質(zhì)量濃度的動態(tài)飄逸倍數(shù)，由k=（1+0.001 235×n0.419 5）n可知，當(dāng)n=29時，動態(tài)飄逸系數(shù)k29=1.158，k29比k0增加了15.8%，檢測偏差會超過2015年版《中國藥典》（四部）對生物樣品定量分析準(zhǔn)確度的要求（15%之內(nèi)）[13]，應(yīng)引起TDM工作者的注意。此外，由于EMIT法測定環(huán)孢素血藥濃度的定量上限為500 ng/mL，而當(dāng)n=87時，k87=2.007，其實測質(zhì)量濃度會增加1倍，故第87次以后的檢測，預(yù)估環(huán)孢素質(zhì)量濃度>250 ng/mL的全血樣品應(yīng)先用空白全血稀釋1倍后再行檢測；該法的定量下限為40 ng/mL，當(dāng)k>3時，檢測全血樣品的真實質(zhì)量濃度可低至14 ng/mL。（2）使用k′ 值，可將環(huán)孢素實測質(zhì)量濃度換算為真實質(zhì)量濃度，有助于獲取更為準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。

3.5 EMIT法檢測環(huán)孢素藥物濃度的校正方法比較

（1）定標(biāo)法：當(dāng)實測質(zhì)量濃度與真實質(zhì)量濃度存在較大偏差時，首先考慮的是重新定標(biāo)，優(yōu)點是重新獲得定標(biāo)曲線，且短期內(nèi)準(zhǔn)確度較高；但會造成昂貴試劑的大量浪費，且使用不久后便會再次出現(xiàn)較大偏差，不得不重新定標(biāo)，對于批量檢測較少的實驗室而言，勢必會增加檢測成本。（2）質(zhì)控法：即每做10次樣品檢測，便進(jìn)行1次質(zhì)控檢測，用所得的校正系數(shù)來校正環(huán)孢素全血樣品的實測質(zhì)量濃度；或者在批量檢測的樣品盤中放置1個標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品，行同法校正，以解決同批次樣品檢測的準(zhǔn)確性問題[12]。該法的優(yōu)點是短期內(nèi)準(zhǔn)確度好，但不適用于以單個樣品檢測為主的實驗室。（3）動態(tài)飄逸校正法：采用本研究所推擬的動態(tài)飄逸校正系數(shù)，只需不定期進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控驗證檢測，即可清楚了解儀器系統(tǒng)檢測的準(zhǔn)確程度，且經(jīng)校正后的實測質(zhì)量濃度準(zhǔn)確度較高，有效地減少了試劑的浪費。上述3種校正方法均有助于獲取更為真實的實測數(shù)據(jù)，但與前兩者比較，動態(tài)飄逸校正法在減少試劑浪費、提高檢測效率等方面更具有優(yōu)勢。

4 結(jié)語

綜上所述，EMIT法檢測環(huán)孢素藥物濃度存在動態(tài)飄逸現(xiàn)象，可采用本研究推擬所得的動態(tài)飄逸校正系數(shù)對檢測結(jié)果進(jìn)行動態(tài)校正，有助于環(huán)孢素血藥濃度的準(zhǔn)確檢測，可為臨床TDM工作的順利開展提供技術(shù)支持。

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（收稿日期：2017-05-13 修回日期：2018-02-28）

（編輯：張元媛）