高山泉 廖延 姜美花 杜鈺 謝冬梅 祝雙華 彭朝權

【摘要】目的探討小鼠心臟CD51+細胞的分離培養(yǎng)及體外定向誘導分化為血管內皮細胞的可行性，為其治療心臟血管內皮損傷提供理論依據。方法取出日齡為7 d的C57 BL/6乳鼠心臟，用流式分選法分選原代細胞、懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)及純化心臟CD51+細胞。用內皮生長培養(yǎng)基（EGM2）對純化和擴增后的CD51+細胞進行體外誘導內皮分化20 d。誘導后觀察細胞形態(tài)變化；實時熒光定量PCR分析內皮相關基因CD31、CD34、vWF、VEGFR2及VECadherin的mRNA表達；細胞免疫熒光技術、流式表型分析術檢測內皮相關標志CD31、VEGFR2及vWF的表達；測定細胞一氧化氮（NO）含量、行體外血管形成實驗以鑒定其功能。結果誘導內皮分化后細胞變?yōu)槎趟笮危输伮肥瘶优帕猩L；熒光定量PCR結果顯示誘導后細胞CD31、CD34、vWF、VEGFR2、VECadherin的mRNA相對表達量較誘導前增加（t值分別為24529、6383、25872、5256、5255，P均<005）；細胞免疫熒光染色及流式表型分析結果均顯示誘導后細胞表達CD31、VEGFR2及vWF；誘導后細胞NO含量較誘導前增加（t=9549， P=0011）并具有體外形成管腔樣結構的能力。結論心臟CD51+細胞具有在體外定向誘導分化為血管內皮細胞的能力。

【關鍵詞】間充質干細胞；CD51；內皮細胞；誘導分化

In vitro induction of differentiation of cardiac CD51+ cells into vascular endothelial cells in mouse modelsGao Shanquan， Liao Yan， Jiang Meihua， Du Yu， Xie Dongmei， Zhu Shuanghua， Peng Chaoquan Department of Cardiovascular， the Third Affiliated Hospital of Sun Yatsen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding author， Peng Chaoquan， Email： pengcq123456@163 com

【Abstract】ObjectiveTo investigate the feasibility of isolation， culture and in vitro induction of the differentiation of cardiac CD51+ cells into vascular endothelial cells， aiming to provide theoretical evidence for the treatment of cardiac vascular endothelial injury MethodsThe heart tissues were collected from 7dayold C57 BL/6 mice Primary cells were isolated by flow cytometry and cell sorting The cardiac CD51+ cells were cultured and purified by suspension cell culture method After cell purification and proliferation， the cardiac CD51+ cells were subjected to in vitro induction of differentiation into endothelial cells in endothelial cell growth medium2 （EGM2） for 20 days After in vitro induction， the changes in cell morphology were observed The expression levels of CD31， CD34， vWF， VEGFR2 and VECadherin mRNA were quantitatively measured by realtime fluorescent quantitative PCR The expression levels of CD31， VEGFR2 and vWF were detected by immunofluorescent staining and flow cytometric immunophenotying The level of nitric oxide （NO） was measured and the function of the induced endothelial cells was evaluated by angiogenesis assay in vitro ResultsThe morphology of cardiac CD51+ cells was changed from the longspindle to shortspindle shape and the induced cells grew in a cobblestonelike pattern The results of fluorescent quantitative PCR demonstrated that the relative expression levels of CD31， CD34， vWF， VEGFR2 and VECadherin mRNA were significantly upregulated after induction （t=24529， 6383， 25872， 5256 and 5255， all P<005） Both immunofluorescent staining and flow cytometric immunophenotying revealed that the cells expressed CD31， VEGFR2， and vWF after induction The quantity of NO was considerably increased after induction （t=9549， P=0011） and had the ability to form lumenlike structures in vitro ConclusionCardiac CD51+ cells can be induced to differentiate into vascular endothelial cells in vitro

【Key words】Mesenchymal stem cell；CD51；Endothelial cell；Induced differentiation

AMI仍是當今世界范圍內的主要健康負擔[1]。PCI是目前AMI的主要治療手段，但其存在局限性，主要表現(xiàn)在兩方面：一是其無法拯救已壞死心肌，難以避免后期心肌病理重構及慢性心衰的發(fā)生[2]。二是存在PCI術后再狹窄的問題，雖然PCI的手術方式不斷改進、抗血小板藥物及藥物洗脫支架的普遍運用已顯著降低其發(fā)生率，但目前PCI術后再狹窄的發(fā)生率仍有5%左右[3]。近年來干細胞研究為解決AMI上述兩個臨床問題帶來了新的思路，其中心臟來源的干細胞，被認為是最有希望治療心血管疾病的干細胞之一[4]。本課題組前期研究已證明，心臟來源的CD51+細胞具有較強的自我更新能力和多向分化能力，具有間充質干細胞特性，CD51可作為心臟干細胞的標志物[5]。移植到AMI小鼠心臟的CD51+細胞可促進心肌梗死后心肌修復、血管再生及心功能改善[6]。本研究在此基礎上，進一步對心臟CD51+細胞進行研究，通過體外分離培養(yǎng)小鼠心臟CD51+細胞，并定向誘導其向血管內皮細胞分化，探討其分化成內皮細胞的可行性，為其進一步修復血管內皮損傷、治療PCI術后再狹窄提供理論依據和實驗基礎。

材料與方法

一、實驗動物

無特定病原體C57 BL/6乳鼠10只，雌雄不限，日齡為7 d，購自中山大學實驗動物中心，實驗過程符合倫理學規(guī)定。

二、主要試劑及儀器

DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco），IMDM培養(yǎng)基（Thermo），B27、EGF、bFGF、β巰基乙醇、L谷氨酰胺（Sigma），CT1（R&D），青鏈霉素、胎牛血清、DNA酶I、胰蛋白酶（Gibco），Ⅱ型膠原酶（Sigma），EGM2培養(yǎng)基（Lonza）：包含EBM2基礎培養(yǎng)基、血管內皮生長因子（VEGF）、人表皮生長因子（hEGF）、R3胰島素樣生長因子1（R3IGF1）、抗壞血酸、氫化可的松、人成纖維細胞生長因子β（hFGFβ）、2%胎牛血清、慶大霉素/兩性霉素B，流式抗體PECD51、APCCD31（eBioscience）、APCVEGFR2（Thermo），逆轉錄試劑盒（Thermo），4%多聚甲醛（博士德生物），抗小鼠一抗：CD31一抗、vWF一抗、VEGFR2一抗（Abcam），熒光二抗：594抗大鼠、抗兔、抗綿羊IgG抗體（Thermo），一氧化氮（NO）檢測試劑盒（碧云天生物），BCA蛋白定量試劑盒（Thermo），基質膠（Corning）。

超凈工作臺（NUAIR），自控式CO2恒溫培養(yǎng)箱（NUAIR），相差倒置顯微鏡（Olymus），倒置熒光顯微鏡（Leica），流式細胞分選儀（BDInflux），分析型流式細胞儀（Beckman），實時熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche），超微量紫外、可見光分光光度計（Nanodrop）。

三、實驗方法

1小鼠心臟CD51+細胞的分選

將7 d大的C57 BL/6小鼠斷頸處死后取心臟并將其剪碎，加入Ⅱ型膠原酶和DNA酶Ⅰ，組織細胞勻漿儀將其制成細胞懸液，1 100 r/min離心4 min， HBSS沖洗、離心、過濾、重懸，將其濃度調整為1×108/ml，加入抗小鼠PE CD51（1∶20）流式抗體，4℃避光孵育30 min，清洗后1 100 r/min離心4 min、重懸后用流式細胞分選儀收集CD51+細胞。

2小鼠心臟CD51+細胞的體外培養(yǎng)與擴增

用心臟干細胞培養(yǎng)基，配方：以65∶35將 DMEM/F12培養(yǎng)基和IMDM培養(yǎng)基混合，再加入2% B27、4 ng/ml CT1、10 μg/ml EGF、160 μg/ml bFGF、1%谷氨酰胺、01 mmol/L β巰基乙醇、1%青鏈霉素。置CO2溫箱中培養(yǎng)，2至3 d換液1次，025%胰蛋白酶（含002% EDTA）消化傳代。

3體外誘導小鼠心臟CD51+細胞向血管內皮細胞分化

取純化后第3代心臟CD51+細胞，換用EGM2培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔日半量換液，誘導培養(yǎng)20 d后備用。

4細胞RNA提取、逆轉錄及實時熒光定量PCR

細胞加入1 ml Trizol吹打后移入新EP管，加入200 μl氯仿，劇烈震蕩15 s后室溫放置2～3 min；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，吸取上層液移進新EP管，加入500 μl異丙醇，混勻后室溫放置10 min；4 ℃ 12 000 r/min離心10 min；沉淀加無水乙醇洗滌、晾干后用DEPC水溶解，測定RNA濃度。逆轉錄試劑盒合成cDNA。后行熒光定量PCR。引物序列見表1。循環(huán)程序為：95 ℃ 5 min預變性，95 ℃ 30 s進行40個循環(huán)，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s并收集熒光信號。

6細胞內皮相關標志的流式免疫表型分析

細胞消化后分3組，前2組分別加入APC標記的CD31、 VEGFR2流式抗體，4℃避光孵育40 min，PBS洗3次，并做空白對照。第3組細胞先用01% tritonX100穿透10 min后，再加入vWF一抗，孵育40 min，PBS洗3次后加入熒光二抗，避光孵育30 min，PBS洗3次，并做陰性對照。最后用流式細胞分析儀檢測。

7細胞的NO含量測定

采用Griess法測定細胞NO含量，利用亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸作用生成的不穩(wěn)定的化合物再與α萘胺作用生成紅色偶氮化合物，然后測定其540 nm波長下的吸光度，最后通過繪制標準曲線及蛋白濃度定量，得出細胞NO含量。采用碧云天NO檢測試劑盒，按說明書步驟進行操作。

8細胞的體外成管實驗

基質膠4 ℃溶解并預冷96孔板、槍頭，第二日冰上操作：96孔板每孔加入50 μl基質膠（過程避免氣泡），置于溫箱30 min，期間消化細胞并計數，調整濃度為2×106～3×106個/ml，隨后每孔加50 μl細胞懸液（濃度為1×104～15×104個/ml），置CO2溫箱中培養(yǎng)4～6 h，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 130進行數據分析。定量數據以±s表示，采用配對t檢驗進行統(tǒng)計分析。P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、小鼠心臟CD51+細胞的生長特性

在不含F(xiàn)BS的心臟干細胞培養(yǎng)基中，小鼠心臟CD51+細胞為大小不一的圓形，胞體折光性強，呈懸浮生長，并可見聚集成球現(xiàn)象。加入2% FBS后出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，細胞體積變大，形態(tài)變?yōu)楸馄綘铋L梭形，折光性逐漸減弱，并可見渦旋狀生長，見圖1。

二、小鼠心臟CD51+細胞誘導內皮分化后的細胞生長特性

誘導內皮分化后，小鼠心臟CD51+細胞形態(tài)逐漸變化，表現(xiàn)為胞體逐漸收縮變短，由長梭形變?yōu)槎趟笮位虮馄蕉嘟切?，并排列成鋪路石樣，細胞邊界清楚，表現(xiàn)出典型的內皮細胞形態(tài)特點，見圖2。

三、細胞誘導內皮分化后內皮相關基因的mRNA相對表達量增加

熒光定量PCR結果顯示，細胞誘導內皮分化后與誘導前相比，CD31（t=24529， P=0002）、CD34（t=6383， P=0024）、vWF（t=25872， P=0001）、VEGRR2（t=5256， P=0034）、VECadherin（t=5255， P=0034）的mRNA相對表達量均增加，見圖3。

五、流式鑒定顯示誘導內皮分化后細胞表型發(fā)生內皮化改變

流式檢測結果顯示，誘導內皮分化后細胞表型發(fā)生變化，與誘導前相比，表達內皮細胞相關標志CD31、VEGFR2、vWF的細胞比例明顯增加，見圖5。

六、誘導內皮分化后細胞的NO含量增加

結果顯示，誘導內皮分化后細胞的NO含量增加（t=9549，P=0011），是誘導前的近3倍，見圖6。

七、誘導內皮分化后細胞具有體外血管形成能力

誘導內皮分化后的細胞接種于基質膠后，細胞逐漸貼壁黏附，向四周發(fā)散生長并逐漸形成分散的網狀，4～6 h后可形成閉合的多邊形管腔樣結構；誘導前細胞無形成官腔樣結構的能力，見圖7。

圖4小鼠心臟CD51+細胞誘導內皮分化后的內皮相關標志的免疫熒光染色（×200）

A：CD31；B：VEGFR2；C：vWF

圖5流式檢測分析小鼠心臟CD51+細胞誘導內皮分化前后的內皮相關標志物的表達

A：CD31；B：VEGFR2；C：vWF；紅色：誘導前；綠色：誘導后

圖6小鼠心臟CD51+細胞誘導內皮分化

前后的NO相對含量比較

*P<005

討論

目前，PCI術后再狹窄仍是無法避免且影響遠期療效的重要并發(fā)癥，可導致心絞痛復發(fā)甚至急性冠脈綜合征，需要再次血運重建。作為一項微創(chuàng)操作，PCI術中導絲、球囊、支架等都可能會不可避免地對血管造成牽拉、擠壓甚至撕裂等損傷，從而導致血管內皮層受到損傷[7]。研究表明，內皮損傷后，如果不能盡快恢復內皮的完整性，中膜平滑肌則會開始增殖，形成細胞外基質并向內膜遷移覆蓋，加上機械性損傷、異物支架的植入會激活炎癥反應及血管活性物質從而導致血小板聚集、血栓形成，最終共同導致PCI術后再狹窄的發(fā)生[814]?？梢?，再狹窄發(fā)生的核心環(huán)節(jié)是血管內皮層的損傷。因此，支架植入后加速受損內膜的再內皮化修復是從根本上降低術后再狹窄發(fā)生率的有效手段。

近年來干細胞治療為解決上述臨床問題帶來了新的思路，目前關于再狹窄的細胞治療，研究較多的是內皮祖細胞（EPCs）和骨髓間充質干細胞（MSCs）。雖然有報道稱它們對促進內膜修復有積極作用，但目前仍有許多不確定因素和爭議，如EPCs缺乏表面特異性標志物，其動員、分化、歸巢的信號通路及參與其中的細胞因子尚不明確；非選擇性骨髓MSCs不僅會促進內皮細胞增殖，還可促進平滑肌增殖，可能反而促進再狹窄的發(fā)生[1517]。研究顯示，腎臟、心臟等多種臟器、組織中存在的MSCs，不但同樣有損傷修復能力，而且對其來源的特定臟器、組織的損傷修復能力可能要優(yōu)于骨髓來源的MSCs[18]。同時由于心臟和血管在胚胎發(fā)育時共同起源于中胚層，所以心臟來源的干細胞，目前被認為是最有希望治療心血管疾病的

圖7小鼠心臟CD51+細胞誘導內皮分化前后的體外血管形成能力比較（×50）

A：誘導前；B：誘導后干細胞之一。但目前心臟干細胞尚沒有統(tǒng)一、明確的表面標記物[19]。因此，尋找其特異的表面標記物，并證明其對心功能及內皮損傷的修復作用具有重要意義。CD51又稱為整合素蛋白αV，其對胚胎器官生成、血管生成等過程起重要的調節(jié)作用[20]。本課題組前期研究已證明，心臟來源的CD51+細胞具有較強的自我更新能力和多向分化能力，具有間充質干細胞特性。移植到AMI小鼠心臟的CD51+細胞可分化為成熟心肌細胞，并促進梗死區(qū)周邊血管再生，從而促進心梗后心功能改善。因此，本研究采用心臟CD51+細胞作為誘導內皮分化的種子細胞，探討其誘導分化為內皮細胞的潛力，以期為治療PCI術后再狹窄提供新的思路和實驗基礎。

雖然目前干細胞向內皮細胞誘導分化的機制尚未清楚，誘導的條件也不盡相同，但誘導因子中均含有VEGF，即模擬體內內皮細胞分化的微環(huán)境，促進內皮基因的開放和表達，從而完成向內皮細胞的誘導分化。本實驗在Kuwana等[21]的誘導方法基礎上進一步改進，用包含VEGF、hEGF、R3IGF1、hFGFβ等多種因子的EGM2培養(yǎng)基對小鼠心臟CD51+細胞進行誘導培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)誘導后細胞形態(tài)逐漸變?yōu)殇伮肥瘶优帕械牡湫蛢绕ぜ毎螒B(tài)。實時熒光定量PCR證明誘導后細胞的內皮相關基因的mRNA表達量顯著增加，免疫熒光染色、流式表型分析結果均顯示誘導后細胞表達內皮特異性標志物，其中除成熟內皮細胞特異性標志CD31、vWF顯著增加外，VEGFR2、VECadherin、CD34也明顯增加。VEGFR2是內皮細胞重要的增殖性標志物，其可維持內皮細胞存活、促進其增殖、阻止其凋亡，進而加快內膜的內皮化，使內膜屏障功能得以盡快恢復[22]。VECadherin即血管內皮鈣黏蛋白，對維持內皮細胞極性和血管完整性起重要作用[23]。CD34多表達于血管新生旺盛的組織中，對血管新生、維持內皮細胞單層結構有重要作用。這些結果不僅證明了誘導后細胞具有內皮細胞特征，還說明誘導后細胞將有利于損傷血管內膜屏障的修復。另外，有功能的成熟內皮細胞的重要特征是合成NO、可在基質膠上黏附、遷移并最終形成管腔樣結構。本研究采用細胞NO含量測定及基質膠成管實驗，均進一步證明了誘導后細胞初步具有血管內皮細胞的生物學功能活性。

綜上所述，本實驗從多方面證實了心臟來源的CD51+細胞具有向內皮細胞分化的潛能，這就為下一步開展動物實驗進一步探討其修復內皮損傷的能力提供了實驗基礎，也為臨床治療PCI術后再狹窄提供了新的思路和細胞來源。

參考文獻

[1]Go AS， Mozaffarian D， Roger VL， Benjamin EJ， Berry JD， Borden WB， Bravata DM， Dai S， Ford ES， Fox CS， Franco S， Fullerton HJ， Gillespie C， Hailpern SM， Heit JA， Howard VJ， Huffman MD， Kissela BM， Kittner SJ， Lackland DT， Lichtman JH， Lisabeth LD， Magid D， Marcus GM， Marelli A， Matchar DB， McGuire DK， Mohler ER， Moy CS， Mussolino ME， Nichol G， Paynter NP， Schreiner PJ， Sorlie PD， Stein J， Turan TN， Virani SS， Wong ND， Woo D， Turner MB； American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee Executive summary： heart disease and stroke statistics——2013 update： a report from the American Heart Association Circulation， 2013，127（1）：143152

[2]Haeck ML， Hoogslag GE， Rodrigo SF， Atsma DE， Klautz RJ， van der Wall EE， Schalij MJ， Verwey HF Treatment options in endstage heart failure： where to go from here？ Neth Heart J，2012，20（4）：167175

[3]Bulum J， Ernst A， Strozzi M The impact of successful manual thrombus aspiration on instent restenosis after primary PCI： angiographic and clinical followup Coron Artery Dis，2012，23（7）：487491

[4]Andersen DC， Andersen P， Schneider M，Jensen HB， Sheikh SP Murine “cardiospheres” are not a source of stem cells with cardiomyogenic potentialStem Cells，2009，27（7）：15711581

[5]陳陽，李桂蘭，姜美花，彭朝權 小鼠心源性CD51陽性細胞的分離與鑒定 中山大學學報（醫(yī)學科學版），2014，35（3）：424430

[6]林婉文，楊珂，廖延，姜美花，彭朝權 CD51陽性心肌細胞對心肌梗死后小鼠心功能改善的作用 新醫(yī)學，2015，46（6）：350355

[7]王正東，李平，林智海，甘劍挺 血管損傷及PCI術后再狹窄機制的研究進展和相應對策 醫(yī)學綜述，2016，22（2）：280283

[8]Kwon JS， Kim YS， Cho AS， Kim JS， Jeong SY， Hong MH， Jeong MH， Ahn Y Origin of restenosis after drugeluting stent implantation in hyperglycemia is inflammatory cells and thrombus J Atheroscler Thromb， 2011，18（7）：604615

[9]Perkins LE Preclinical models of restenosis and their application in the evaluation of drugeluting stent systemsVet Pathol，2010，47（1）：5876

[10]Guerra E， Byrne RA， Kastrati A Pharmacological inhibition of coronary restenosis： systemic and local approaches Expert Opin Pharmacother，2014，15（15）：21552171

[11]Lupi A， Secco GG， Rognoni A， Rossi L， Lazzero M， Nardi F， Rolla R， Bellomo G， Bongo AS， Di Mario C Plasma fibrinogen levels and restenosis after primary percutaneous coronary intervention J Thromb Thrombolysis，2012，33（4）：308317

[12]Gutman D， Golomb G Liposomal alendronate for the treatment of restenosis J Control Release，2012，161（2）：619627

[13]Chaabane C， Otsuka F， Virmani R， BochatonPiallat ML Biological responses in stented arteriesCardiovasc Res，2013，99（2）：353363

[14]Cassese S， Byrne RA， Tada T， Pinieck S， Joner M， Ibrahim T， King LA， Fusaro M， Laugwitz KL， Kastrati A Incidence and predictors of restenosis after coronary stenting in 10 004 patients with surveillance angiographyHeart，2014，100（2）：153159

[15]沈根，張順，葉紅華 他汀類藥物對內皮祖細胞作用的研究進展 新醫(yī)學，2015，46（12）：789793

[16]孫文博，王賀，司春嬰，解金紅，陳玉善，柴爽爽，關懷敏 內皮祖細胞對藥物洗脫支架置入術后再狹窄及再內皮化影響的研究進展 中國醫(yī)藥導報，2016，13（24）：5457

[17]Liao J， Chen X， Li Y，Ge Z， Duan H， Zou Y， Ge J Transfer of bonemarrowderived mesenchymal stem cells influences vascular remodeling and calcification after balloon injury in hyperlipidemic rats J Biomed Biotechnol，2012，2012：165296

[18]Fuchs E， Tumbar T， Guasch G Socializing with the neighbors： stem cells and their niche Cell，2004，116（6）：769778

[19]Beltrami AP， Barlucchi L， Torella D， Baker M， Limana F， Chimenti S， Kasahara H， Rota M， Musso E， Urbanek K， Leri A， Kajstura J， NadalGinard B， Anversa P Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration Cell，2003，114（6）：763776

[20]Sheppard D Roles of alphav integrins in vascular biology and pulmonary pathologyCurr Opin Cell Biol，2004，16（5）：552557

[21]Kuwana M， Okazaki Y， Kodama H， Satoh T， Kawakami Y， Ikeda Y Endothelial differentiation potential of human monocytederived multipotential cellsStem Cells，2006，24（12）：27332743

[22]胡慶松，聶如瓊 血管內皮細胞標志物研究進展 嶺南心血管病雜志，2012，18（2）：196 201

[23]Vestweber D VEcadherin： the major endothelial adhesion molecule controlling cellular junctions and blood vessel formationArterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28（2）：223232

（收稿日期：20180108）

（本文編輯：楊江瑜）