曾玲芳　王億君　吳依辰　章慧

〔摘要〕 目的 觀察黃連素聯(lián)合順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響并探討其相關(guān)機(jī)制。方法 以A549/DDP細(xì)胞為研究對(duì)象，分別加入12 μg/mL的順鉑、濃度為20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的黃連素+12 μg/mL的順鉑，設(shè)置空白對(duì)照孔（PBS孔），分別用藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；各組用藥干預(yù)48 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blot 法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)情況，Real-time PCR法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 黃連素聯(lián)合順鉑能夠抑制A549/DDP細(xì)胞增殖（P<0.01），并具有一定的時(shí)間-濃度依賴(lài)性。黃連素聯(lián)合順鉑能夠誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞A549/DDP凋亡（P<0.01），且呈一定的濃度依賴(lài)性。不同濃度的黃連素聯(lián)合順鉑使促凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9、Bax在蛋白和mRNA水平表達(dá)上調(diào)（P<0.05），而抗凋亡基因Bcl-2在蛋白和mRNA水平表達(dá)下調(diào)（P<0.05）。結(jié)論 黃連素聯(lián)合順鉑抑制A549/DDP細(xì)胞增殖和促凋亡的分子機(jī)制可能是上調(diào)促凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9、Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕 黃連素；順鉑；肺癌耐藥；細(xì)胞凋亡

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5；R734.2 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.05.002

An Experimental Study on Apoptosis of A549 / DDP Cells Induced by Berberine

Combined with Cisplatin

ZENG Lingfang1， WANG Yijun1， WU Yichen1， ZHANG Hui2*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China；

2. Hunan Cancer Hospital， Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of berberine combined with cisplatin on cell apoptosis of A549 / DDP and investgate its related mechanism. Methods Human lung cancer resistance A549 / DDP cells， as the object of study， were added with 12 μg/mL cisplatin， and 20 μmol/L， 40 μmol/L， 80 μmol/L berberine combined with 12 μg/mL cisplatin， respectively， blank control wells （PBS wells） were set up， they were all treated with drugs for 24 h， 48 h and 72 h. The cell proliferation was evaluated by MTT assay. After intervention with drugs for 48 h， cell apoptosis was determined by using the flow cytometry instrument. The protein and mRNA levels of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2 were measured by Real-time PCR and western blotting analysis， respectively. Results Berberine combined with cisplatin could inhibit the growth of A549 / DDP cells （P<0.01） and promote apoptosis of A549/DDP cells （P<0.01）， with a certain time-concentration dependence. Different concentrations of berberine combined with cisplatin increased the levels of protein and mRNA levels of apoptosis genes Caspase-3， Caspase-9， Bax （P<0.05）， and down-regulated the protein and mRNA levels of anti-apoptosis gene Bcl-2 （P<0.05）. Conclusion The molecular mechanism of berberine combined with cisplatin in inhibiting proliferation and promoting apoptosis of A549 / DDP cells may be related to up-regulating the expression of apoptosis related proteins Caspase-3， Caspase-9 and Bax， downregulating the expression of anti-apoptosis protein Bcl-2.

〔Keywords〕 berberine； cisplatin； lung cancer drug resistance； cell apoptosis

肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率和死亡率均明顯增高，據(jù)我國(guó)癌癥中心2017年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示：2013年肺癌在我國(guó)惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率均位居榜首[1]?；熓欠伟┚C合治療的重要手段之一，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）占肺癌的80%以上，以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的二藥聯(lián)合方案是目前公認(rèn)的晚期NSCLC 的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，但肺癌的一線化療有效率僅為20%～40%[2]，二線化療有效率更低，其主要原因?yàn)榉伟?duì)化療藥物極易產(chǎn)生耐藥性[3]。因此，肺癌耐藥已成為化療的“治療性瓶頸”，是肺癌臨床治療中的棘手問(wèn)題[4]。黃連素，提取自中藥黃連、黃柏。黃連、黃柏，以其大苦大寒之性，最善攻毒、排毒、解毒，是一類(lèi)運(yùn)用廣泛的植物藥[5]。黃連素[6-13]在誘導(dǎo)食管癌、乳腺癌等其他腫瘤細(xì)胞凋亡方面已有相關(guān)報(bào)道，但尚未有關(guān)于黃連素誘導(dǎo)人肺癌耐藥A549/DDP細(xì)胞凋亡的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察黃連素聯(lián)合順鉑對(duì)A549/DDP細(xì)胞凋亡的影響并探討其相關(guān)機(jī)制，為黃連素能夠進(jìn)一步應(yīng)用于臨床，克服肺癌順鉑耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

人肺癌耐藥細(xì)胞株A549/DDP購(gòu)自中南大學(xué)腫瘤研究所；黃連素購(gòu)于美國(guó)Sigma公司（批號(hào)：PHR1502）；順鉑為山東齊魯醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：H20023460）。

1.2 主要試劑

MTT粉（德國(guó)Serva公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國(guó)Sigma公司）；一抗caspase-3（英國(guó)abcam，Rabbit）、一抗caspase-9（美國(guó)proteitech，Rabbit）；一抗bcl-2（美國(guó)santa cruz，Mouse）、一抗bax抗體（美國(guó)santa cruz，Rabbit）；β-actin抗體（美國(guó)proteitech，Mouse）；goat anti-mouse IgG、 goat anti-rabbit IgG（美國(guó)proteintech）；顯影液（中國(guó)WellBiology）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）；PCR引物（南京金斯瑞公司）。

1.3 主要儀器

FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀（BD公司）、DYCZ-40A轉(zhuǎn)膜儀（中國(guó)北京六一）、PIKO REAL 96熒光定量PCR儀（Thermo）、SPL0960熒光PCR板（Thermo）。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組 （1）對(duì)照組：PBS組；（2）順鉑組：以12 mg/L的DDP處理；（3）低、中、高濃度黃連素+DDP組：濃度分別為20、40、80 μmol/L的黃連素+ 12 mg/L的DDP處理。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 人肺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP培養(yǎng)于含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，用 2 μg/mL順鉑維持其耐藥性，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，細(xì)胞密度達(dá)80%左右，胰酶消化細(xì)胞，一分為二進(jìn)行傳代。實(shí)驗(yàn)前1周換成不含順鉑的培養(yǎng)基以減少順鉑對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。

1.4.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化，加入到RPMI-1640培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，以密度為1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96 孔板內(nèi)；采用12 mg/L的DDP、濃度為20、40、80 μmol/L的黃連素+12 mg/L的DDP作用于A549/DDP細(xì)胞24、48、72 h，每組均設(shè)4復(fù)孔；每孔加入MTT 20 μL繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清，加入二甲基亞砜，充分震蕩混勻；用Bio-Tek酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm處吸光度值；計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組/對(duì)照組）×100%。

1.4.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取各組藥物干預(yù)48 h的細(xì)胞，用不含EDTA的胰酶消化后，用含 12%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，吸取單細(xì)胞懸液至離心管中；PBS洗滌2次后以2 000 r/min離心5 min，收集約1×105～5×105細(xì)胞；加入500 μL的Binding buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光，反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)，在流式細(xì)胞儀觀察檢測(cè)。

1.4.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 各組藥物干預(yù)48 h的細(xì)胞洗滌離心，加入RIPA裂解液提取樣品蛋白。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明操作，測(cè)定蛋白濃度。電泳后轉(zhuǎn)膜，將膜放置于脫脂牛奶中室溫1 h。將一抗按一定比例稀釋后（Bax、Bcl-2、Caspase-3均按1∶200稀釋?zhuān)珻aspase-9按1∶500稀釋?zhuān)┡c膜孵育，孵育結(jié)束后用1×TBST洗3次。用HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例1∶3 000）與膜孵育。最后以ECL顯色曝光，將曝光后的底片掃描，并用quantity one專(zhuān)業(yè)灰度分析軟件進(jìn)行分析，并以β-actin作為內(nèi)參條帶。

1.4.6 RT-PCR檢測(cè)Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA、Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達(dá)水平 Trizol提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣品完整性。按HiFiScript試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為42 ℃孵育30～50 min，逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)85 ℃孵育5 min。按SYBR實(shí)時(shí)熒光定量PCR法反應(yīng)體系進(jìn)行PCR反應(yīng)。由南京金斯瑞合成PCR引物，序列如下：Caspase-3-F：5-GGTTCATCCAGTCGCTTTG-3；Caspase-3-R：5-TTCTGTTGCCACCTTTCG-3；product length：98 bp。Caspase-9-F：5-AAAGTTGTCGAAGCCAACCCTAG-3；Caspase-9-R：5-CAAATCCTCCAGAACCAATGTCC-3； product length：122 bp。Bcl-2-F：5-ATTGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3；Bcl-2-R：5-CCTACCCAGCCTCCGTTATCC-3；product length：152 bp。bax-F：5-CCAGGATGCGTCCACCAAGAA-3；bax-R：5-CCGTGTCCACGTCAGCAATCA-3；product length：104 bp。actin-F：5-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3；actin-R：5-TAATGTCACGCACGATTTCC-3product length：107 bp。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別擴(kuò)增Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2基因，得到3組△Ct，按照公式△Ct=目的△Ct-內(nèi)參△Ct，-ΔΔCt=（對(duì)照組）ΔCt平均值-各樣品ΔCt，2-ΔΔCt計(jì)算各樣品相對(duì)于對(duì)照組樣品目的基因的表達(dá)水平（本實(shí)驗(yàn)以PBS樣為對(duì)照樣品）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)“x±s”表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），不滿足方差分析條件的則用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值

結(jié)果如表1所示：從中可以看出，作用24 h、48 h、72 h，與PBS組對(duì)比，低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組、順鉑組對(duì)A549/DDP細(xì)胞增值抑制率差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；隨著黃連素濃度增加，抑制率逐漸增高。

黃連素聯(lián)合順鉑能夠抑制A549/DDP細(xì)胞增殖，且有一定的時(shí)間和濃度依賴(lài)性。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

結(jié)果如表2及圖1所示：順鉑組及低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組細(xì)胞凋亡率均高于PBS組，并且差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但中濃度黃連素聯(lián)合順鉑組和高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組兩組之間比較，細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

黃連素聯(lián)合順鉑能夠誘導(dǎo)耐藥細(xì)胞A549/DDP凋亡，且呈一定的濃度依賴(lài)性。

2.3 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

結(jié)果如圖2及表3所示：與PBS組相比，順鉑組，低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組促凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase9、Bax表達(dá)明顯增強(qiáng)（P<0.05），且低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組與順鉑組之間比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），隨著濃度增加，促凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase9、Bax的表達(dá)呈上升趨勢(shì)；抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯減弱（P<0.05），且低、中、高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組與順鉑組之間比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），隨著濃度增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。

黃連素能夠增強(qiáng)A549/DDP細(xì)胞促凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase9、Bax的表達(dá)，減弱抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，并具有濃度依賴(lài)性。

2.4 RT-PCR法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2的mRNA水平

結(jié)果如表4所示：與PBS組相比，DDP組、低中高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組促凋亡相關(guān)mRNA caspase-3、caspase-9、bax表達(dá)明顯上調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），DDP組、低中高濃度黃連素聯(lián)合順鉑組抗凋亡mRNA bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

黃連素聯(lián)合順鉑能夠增強(qiáng)caspase-3、caspase-9、bax的mRNA表達(dá)，減弱bcl-2的mRNA表達(dá)，并具有一定的濃度依賴(lài)性。

3 討論

腫瘤是細(xì)胞分裂與細(xì)胞死亡失衡的一類(lèi)疾病，細(xì)胞凋亡障礙在惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）是一組與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白酶，是細(xì)胞凋亡的中央處理器。Caspase家族分為三大類(lèi)：凋亡啟動(dòng)因子、凋亡執(zhí)行因子和炎癥介導(dǎo)因子，在細(xì)胞凋亡中構(gòu)成級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。凋亡啟動(dòng)因子位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游，以caspase-9為代表，能在其它蛋白輔助下發(fā)生自我活化并識(shí)別和激活下游的caspase。凋亡執(zhí)行因子在級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，作用于其特異性底物并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。如Caspase-3，是caspase家族中的最重要的凋亡執(zhí)行者之一，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的主要效應(yīng)因子，它的活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入了不可逆階段。不管是死亡受體介導(dǎo)的外源性凋亡途徑還是線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑，Caspase-3和Caspase-9都發(fā)揮了作用，其中Caspase-3是外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑的匯集點(diǎn)。

Bcl-2家族蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡具有雙向調(diào)節(jié)作用，其作用部位主要是線粒體外膜，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體的膜孔隙形成蛋白[14]，從而調(diào)節(jié)線粒體釋放促凋亡因子，參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能不同分為兩類(lèi)，一類(lèi)是以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白，另一類(lèi)是以Bax為代表的促凋亡蛋白。Bax蛋白能在較為廣泛的PH范圍內(nèi)形成孔道，允許一些離子和小分子如細(xì)胞色素c等穿過(guò)線粒體膜，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，從而引起細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2蛋白的作用正好相反，它能封閉Bax蛋白形成孔道的活性，使一些小分子不能自由通過(guò)，從而保護(hù)細(xì)胞凋亡。近年來(lái)的研究認(rèn)為Bcl-2蛋白可能是通過(guò)清除線粒體活性氧，抑制多種線粒體凋亡蛋白的釋放如細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)，阻止Caspase的進(jìn)一步激活，從而抑制細(xì)胞凋亡[15]。Bax蛋白是Bcl-2家族的前凋亡蛋白，一般存在于胞漿中，并作為一種細(xì)胞損傷和刺激的傳感器。當(dāng)響應(yīng)損傷和刺激時(shí)，Bax蛋白將重新定位于線粒體表面并破壞在正常狀態(tài)下抗凋亡的Bcl-2蛋白的功能。一般來(lái)說(shuō)，在胞漿中的Bax以單體形式存在，然而在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，與線粒體關(guān)聯(lián)的Bax既可能以無(wú)活性的單體形式存在，也可能以與線粒體膜結(jié)合的大分子量的活性復(fù)合物形式存在。Bax可以構(gòu)成跨線粒體外膜的孔，并促使膜電位的降低和細(xì)胞色素C（Cyt C）及凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的外流，細(xì)胞色素C與Apaf-1和ATP及Pro-Caspase-9形成復(fù)合物（凋亡體）并導(dǎo)致Caspase-9的激活。與細(xì)胞色素C的結(jié)合使Apaf-1與pro-Caspase-9的結(jié)合能力更強(qiáng)。

黃連素提取自黃連、黃柏，根據(jù)藥物功效確定的中醫(yī)歸經(jīng)理論中，均沒(méi)有關(guān)于黃連、黃柏入肺經(jīng)的記載。黃連入藥，除生用外，還有酒炙、姜汁炙、吳茱萸水炙等多種炮制方法，其功效各異。其中臨床上多用姜黃連清胃熱和胃止嘔，然酒黃連善清上焦火熱卻少有人知，更無(wú)謂于臨床使用。肺位居上焦，為五臟六腑之華蓋，肺為嬌臟，喜潤(rùn)惡燥，結(jié)合其生理病理特點(diǎn)，可以將肺癌的病機(jī)概括為氣陰虧虛，瘀毒內(nèi)結(jié)，黃連雖不入肺經(jīng)，然酒黃連以其善清上焦火熱之功效而能夠治療肺癌，且現(xiàn)代藥理學(xué)研究已經(jīng)顯示黃連素具有誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的作用[16]。

實(shí)驗(yàn)中我們采用不同濃度的黃連素聯(lián)合順鉑作用于A549/DDP細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)黃連素聯(lián)合順鉑能夠抑制人肺癌耐藥A549/DDP細(xì)胞增值，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在分子水平上進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，黃連素聯(lián)合順鉑能夠增強(qiáng)促凋亡因子Caspase-3、Caspase-9、Bax在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，減弱抗凋亡因子Bcl-2在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，由此我們可以推論黃連素聯(lián)合順鉑抑制A549/DDP細(xì)胞增殖和促凋亡的分子機(jī)制可能是上調(diào)促凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。

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