王佳琳 張貴君 郭亞芳 彭慧 孫啟玉 劉亮 王月 劉傲雪

摘要 目的：研究煎煮時間對梔子柏皮湯藥效組分的影響，為梔子柏皮湯的質(zhì)量控制與臨床實際應用提供理論依據(jù)。方法：采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法同時測定不同煎煮時間（10，20，30，40，50，60 min）梔子柏皮湯藥效組分梔子苷-京尼平龍膽雙糖苷-木蘭花堿-甘草苷（λ=238 nm）、鹽酸小檗堿-鹽酸巴馬汀-甘草酸（λ=265 nm）、異甘草苷（λ=360 nm）、西紅花苷Ⅰ-西紅花苷Ⅱ（λ=440 nm）的含量。結(jié)果：當煎煮時間改變時，各成分的變化趨勢不盡相同；梔子、黃柏、炙甘草藥效組分及藥效組分總量不同煎煮時間下變化顯著，梔子、黃柏、炙甘草藥效組分以及藥效組分總量在10～20 min均有大幅度上升，20 min后出現(xiàn)不同程度的減少后含量增加，最終含量與20 min時大致相近。結(jié)論：不同煎煮時間影響梔子柏皮湯藥效組分的溶出，從而影響療效；當煎煮時間為20 min，各組分含量較高，且避免了因受熱時間過長對西紅花苷類成分的破壞，驗證了傳統(tǒng)煎煮時間的合理性。

關(guān)鍵詞 梔子柏皮湯；梔子苷；鹽酸小檗堿；甘草酸；煎煮時間；藥效組分；HPLC-DAD多波長切換法；含量測定

Abstract Objective：To study the effect of decocting time on the active components of Zhizi Baipi decoction， and provide the scientific basis for quality control and clinical application of Zhizi Baipi decoction. Methods：HPLC-DAD was employed to determine the content of geniposide-genipin1gentiobioside-magnoflorine-liquiriti-n （λ=238 nm）， glycyrrhizic acid-berberine hydrochloride-palmatinechloride （λ=265 nm）， isliquiritin （λ=360 nm）， crocinⅠ-crocinⅡ （λ=440 nm） in Zhizi Baipi decoction at various decocting time. Results：When the decocting time changes， each ingredient has different variation trend； Fructus gardeniae， Phellodendron amurense， Glycyrrhica uralensis and the total active components have significant difference； Fructus gardeniae， Phellodendron amurense， Glycyrrhica uralensis and the total active components have significant rise during 10～20 min， then decrease in certain extent and increase later. The final content approach the content at 20 min. Conclusion：Different decocting time changed the active components of Zhizi Baipi decoction， thus changed its efficacy； when the decocting time for 20 min， each active component has higher content and it avoids the destruction of crocin by long time heat， which proved the rationality of traditional decocting time.

Key Words Zhizi Baipi Decoction； Geniposide； Berberine hydrochloride； Glycyrrhizinate； Decocting time； Active components alignment； HPLC-DAD with changing； Determination of content

中圖分類號：R283文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.050

湯劑煎煮時間的長短是影響其質(zhì)量的重要因素[1]。一般認為，復方的煎煮時間由其藥味組成特點和療效決定，如含質(zhì)地堅硬的礦石類方劑、滋補類方劑的煎煮時間宜長，而解表劑、清熱劑的煎煮時間宜短，應控制在20 min以內(nèi)[2]。梔子柏皮湯始載于漢代張仲景《傷寒論》，由梔子、黃柏、炙甘草三味藥組成，有清熱利濕之功效，是治療濕熱黃疸的經(jīng)典方劑[3-4]。有研究根據(jù)《傷寒論》中藥量、加水量、煮取量等記載，推算其傳統(tǒng)煎煮時間20 min左右[2]，但對其物質(zhì)基礎(chǔ)的解釋未見報道。

目前對湯劑煎煮時間的研究多停留于單味藥，且往往局限于少數(shù)幾種成分或某類成分，忽略了中藥復方的復雜性和整體性。中藥藥效組分理論認為，復方的療效是由一組具有相關(guān)藥理作用的有效成分按一定含量及比例（即藥效組分）決定的，復方的藥效組分應與其功效相對應，并溶于水，符合湯劑的制備特點[5-7]。故篩選梔子中具利膽作用[8-10]的梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ，黃柏中具抑菌抗炎作用[11-14]的鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、木蘭花堿，甘草中具利膽、抗炎抗病毒等作用[15-17]的甘草苷、異甘草苷、甘草酸，共10種成分作為與梔子柏皮湯清熱利濕功效對應的藥效組分，通過研究煎煮時間對梔子柏皮湯藥效組分的影響，探討煎煮時間與中藥療效的相關(guān)性，解釋傳統(tǒng)煎煮時間的合理性，為梔子柏皮湯的質(zhì)量控制與臨床實際應用提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate 3000 Series型高效液相色譜儀（Thermo）；AL104型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KQ-250B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑 甲醇、乙腈（色譜純，上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?；磷酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；哇哈哈飲用純凈水（杭州哇哈哈集團有限公司）。

1.3 分析樣品 梔子苷（批號151204）、京尼平龍膽雙糖苷（批號16072002）、西紅花苷Ⅰ（批號151116）、西紅花苷Ⅱ（批號16051805）、木蘭花堿（批號151029）、鹽酸巴馬汀（批號151120）、甘草苷（批號141029）、異甘草苷（批號150714）、甘草酸（批號150407），以上對照品購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度均≥98%；鹽酸小檗堿（批號110713-201212，純度≥98%）購自中國食品藥品檢定研究所。梔子、黃柏、炙甘草購自河北省安國市萬聯(lián)中藥飲片有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥學院中藥鑒定系張貴君教授鑒定分別為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis.的干燥成熟果實；蕓香科植物黃皮樹Phellodendron chinense Schneid.的干燥樹皮；豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根莖的蜜炙品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）—0.2%磷酸（B）；梯度洗脫：0～20 min，12%～20% A；20～40 min，20%～23% A；40～70 min，23%～25% A；70～100 min，25%～55% A；100～105 min，55%～12% A；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；檢測波長238 nm（梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、木蘭花堿、甘草苷）；265 nm（鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、甘草酸）；360 nm（異甘草苷）；440 nm（西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ）。在上述色譜條件下，樣品中10種成分的保留時間與對照品一致，10種成分的色譜峰均能達到較好的分離，且樣品其他成分對欲測成分的測定無干擾。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、木蘭花堿、甘草酸、甘草苷、異甘草苷適量，加70%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為16.2、25、24、18、32.5、26.5、17、33、28.5、13 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取梔子10 g、黃柏6 g、炙甘草3 g，共6份，分別加10倍量水，浸泡30 min，先用武火加熱至沸后，以文火分別煎煮10、20、30、40、50、60 min，共煎2次，合并濾液，濃縮至0.1 g/mL。精密量取3 mL濾液至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，離心5 min，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。按上述操作平行制備三批樣品，并制備缺梔子、缺黃柏、缺甘草的陰性樣品溶液。

2.4 專屬性試驗 將各陰性溶液注入高效液相色譜儀，結(jié)果在與對照品色譜峰相應的位置無色譜峰，說明其他藥味不影響測定，色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察 精密稱取京尼平龍膽雙糖苷、甘草苷、西紅花苷Ⅰ、木蘭花堿、甘草酸、異甘草苷、西紅花苷Ⅱ、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀適量，加70%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為376、207.5、180、165、198、24、19.6、78、47.7 μg/mL的混合對照品溶液；另精密稱取梔子苷適量，加70%甲醇制成濃度為1.49 mg/mL的梔子苷對照品溶液；分別精密量取混合對照品溶液及梔子苷對照品溶液4、2、1、0.5、0.25 mL于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，進樣5 μL測定。以峰面積為縱坐標，質(zhì)量濃度為橫坐標進行回歸處理，線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表1。

2.6 中間精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液5 μL，連續(xù)進樣六次，測定并計算梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、木蘭花堿、甘草酸、甘草苷、異甘草苷峰面積的RSD值，結(jié)果分別為0.23%、0.15%、0.3%、0.21%、0.13%、0.25%、0.18%、0.24%、0.14%、0.16%。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 精密吸取煎煮時間為20 min的供試品溶液，分別在制備后0，2，4，8，12，24 h進樣，測定并計算測定并計算梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、木蘭花堿、甘草酸、甘草苷、異甘草苷峰面積的RSD值，結(jié)果分別為0.33%、0.52%、0.47%、0.94%、1.17%、0.75%、1.06%、0.24%、1.63%、1.44%。

2.8 重復性試驗 精密稱取梔子10 g、黃柏6 g、甘草3 g，按2.3項下方法制備6份煎煮時間為20 min的供試品溶液，分別進樣5 μL，測定并計算梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、木蘭花堿、甘草酸、甘草苷、異甘草苷峰面積的RSD值，結(jié)果分別為1.03%、1.18%、1.24%、0.93%、1.21%、1.58%、1.37%、0.84%、1.73%、0.87%。

2.9 回收率試驗 精密吸取已知各成分含量的煎煮時間為20 min的供試品溶液3 mL，平行6份，分別精密加入等量混合對照品溶液，制備成供試品溶液，按照色譜條件進樣，結(jié)果梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、木蘭花堿、甘草酸、甘草苷、異甘草苷的平均回收率分別為98.61%、97.77%、98.44%、97.05%、96.53%、96.99%、96.96%、97.78%、100.25%、98.69%，RSD分別為2.26%、1.16%、1.85%、1.43%、1.07%、1.18%、1.63%、1.83%、1.84%、3.29%。

2.10 樣品測定結(jié)果 將不同煎煮時間的梔子柏皮湯分別按2.3項下方法平行制備3份供試品溶液，每份供試品連續(xù)進樣測定3次，5 μL/次，根據(jù)標準曲線計算10種成分含量，各成分及組分的變化趨勢見圖2。

3 討論

3.1 梔子柏皮湯藥效組分分析方法的篩選 分別應用乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液，流速1、0.8、0.6 mL/min，柱溫30、35、40 ℃，進樣量5、10、20 μL比較研究上述條件下的分離結(jié)果。結(jié)果顯示，乙腈-0.2%磷酸水溶液、流速0.8 mL/min、柱溫30 ℃、進樣量5 μL條件下，分離效果最好。

3.2 煎煮時間對梔子柏皮湯藥效組分的影響

中藥的煎煮過程中，各組分間會隨著煎煮時間的變化產(chǎn)生不同類型的復雜化學反應，一個時間點不可能保證所有藥物有效成分的煎出或不被破壞[18]。從本實驗結(jié)果看，隨著煎煮時間的延長，各藥效組分的變化趨勢不盡相同。多數(shù)化學結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、受熱不易分解的組分隨煎煮時間的延長而增加；部分組分如梔子苷、木蘭花堿當某一時間達到一定含量后趨于平穩(wěn)；少數(shù)組分如西紅花苷類由于化學結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，達到一定量后繼續(xù)加熱含量降低。因此，在考察復方的煎煮時間時應選擇體現(xiàn)復方整體性的藥效組分作為考察指標，以一類成分或少數(shù)幾種成分為指標是不夠全面的。

梔子、黃柏、炙甘草藥效組分以及藥效組分總量均在10～20 min有大幅度上升，20 min后出現(xiàn)不同程度的減少后含量增加，最終含量與20 min時大致相近。煎煮時間由10 min增至60 min，梔子藥效組分含量60>20>30>50>10>40，黃柏藥效組分含量60>20>30>40>10>50，甘草藥效組分含量60>50>20>30>10>40，藥效組分總量60>20>30>50>10>40，藥效組分總量與君藥梔子的變化情況相同，可見瀉三焦實火的君藥梔子在本方中的重要性；當煎煮時間為20 min，各組分含量較高，且避免了因受熱時間過長對西紅花苷類成分的破壞，驗證了傳統(tǒng)煎煮時間的合理性。

梔子、黃柏、炙甘草藥效組分及藥效組分總量不同煎煮時間發(fā)生顯著變化，說明中藥的功效發(fā)生了變化。因此，在實際操作過程中，應嚴格規(guī)范湯劑的煎煮時間，切不可隨意改變，否則不但影響療效，還有可能產(chǎn)生不良反應。

總之，在中醫(yī)藥理論和中藥藥效組分理論的指導下，以經(jīng)典方劑為研究對象，研究煎煮時間對藥效組分的影響，對湯劑的質(zhì)量控制和臨床應用具有重大意義。

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（2017-07-03收稿 責任編輯：楊覺雄）