DNA甲基化與肺動(dòng)脈高壓患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性的研究進(jìn)展

朱才民　李旎　孫樂波　鄭大為　石活順　徐國棟　邵國豐

【摘要】 肺動(dòng)脈高壓是一種嚴(yán)重而無法治愈的肺血管疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。DNA甲基化是在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下調(diào)控基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的表觀遺傳學(xué)修飾。近期研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。該文就近年來對(duì)DNA甲基化影響肺動(dòng)脈高壓形成的研究作一綜述。

【關(guān)鍵詞】 肺動(dòng)脈高壓；DNA甲基化；基因；表觀遺傳學(xué)

【Abstract】 Pulmonary arterial hypertension is a serious and incurable pulmonary vascular disease with complex pathogenesis. DNA methylation is an epigenetic modification that electively regulates the transcriptional expression of genes under the action of methyltransferase. Recent studies have demonstrated that DNA methylation plays a crucial role in the incidence and progression of pulmonary arterial hypertension. This review summarizes recent studies focusing upon the effect of DNA methylation on the incidence of pulmonary arterial hypertension.

【Key words】 Pulmonary arterial hypertension； DNA methylation； Gene； Epigenetics

肺動(dòng)脈高壓（PAH）是以肺血管阻力進(jìn)行性升高，肺動(dòng)脈平均壓力升高為其特性的一種病理生理狀態(tài)，最終致使患者右心功能衰竭而死亡，且發(fā)病以女性為主，女∶ 男比例約為2.3∶ 1，若未及時(shí)診斷并積極干預(yù)，患者一般在出現(xiàn)癥狀后2～3年內(nèi)死亡[1-2]。血流動(dòng)力學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)為：在海平面、靜息狀態(tài)下，右心導(dǎo)管測(cè)量mPAP≥25 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）[3-4]。PAH分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩類。原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（PPH）是目前原因不明的肺動(dòng)脈高壓，屬致命性PAH，是一種少見疾病，包括特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（IPAH）與家族性肺動(dòng)脈高壓（FPAH）。繼發(fā)性PAH可發(fā)生于重癥慢性肺部疾病、心臟瓣膜病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。?、先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、艾滋病等，除有PAH的表現(xiàn)外，還有原發(fā)病的表現(xiàn)，繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓較常見[5]。雖然近年來隨著靶向藥物上市及臨床診療路徑的規(guī)范使得PAH患者生存率有所提高，但從長(zhǎng)期看，預(yù)后仍不容樂觀。

大量研究結(jié)果表明，PAH的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，而表觀遺傳學(xué)正是從遺傳-環(huán)境交互作用的角度來探討疾病的發(fā)生[6-7]。目前對(duì)PAH進(jìn)行DNA甲基化方面的研究很少。然而在其他領(lǐng)域比如癌癥研究中卻十分常見，比如DNA甲基化作為核酸類的腫瘤標(biāo)記物，在胰腺癌的診斷方面具有明顯優(yōu)勢(shì)已被證實(shí)[8]。這些說明在PAH領(lǐng)域中，亟需開展表觀遺傳學(xué)方面的研究。隨著遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)步，有關(guān)PAH的易感基因和致病基因被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。近年來對(duì)IPAH的發(fā)病機(jī)制研究不斷深入，最為重要的進(jìn)展即在分子遺傳方面發(fā)現(xiàn)PAH具有易感性。另外，PAH體外肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)表現(xiàn)為高增殖活性，抗凋亡傾向，與腫瘤發(fā)生機(jī)制相似，PAH可能是由于肺血管細(xì)胞遺傳學(xué)改變所致[9]。

DNA甲基化是在甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下調(diào)控基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的表觀遺傳學(xué)修飾。而越來越多的研究表明PAH患者基因組存在DNA甲基化，并且相關(guān)基因的甲基化也逐漸被提及。現(xiàn)依據(jù)近些年來關(guān)于DNA甲基化修飾與PAH患病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性研究結(jié)果作一綜述。

一、 DNA甲基化修飾

在人所有基因組中大約60% ～90%的胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（CpG）是被甲基修飾的，但CpG島是未被甲基化修飾的[10]。因此DNA甲基化是相對(duì)穩(wěn)定的表觀遺傳學(xué)修飾，甚至可以由細(xì)胞遺傳。一旦DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT）調(diào)節(jié)出現(xiàn)紊亂時(shí)，催化腺苷或胞嘧啶DNA核苷酸通過共價(jià)相互作用添加甲基使DNA構(gòu)象發(fā)生改變，阻礙基因轉(zhuǎn)錄，使得基因表達(dá)受到限制。具有特定堿基序列的CpG島序列通常位于基因啟動(dòng)子中，可以發(fā)生較高的甲基化概率，被認(rèn)為是隱性遺傳的一個(gè)標(biāo)志。DNA甲基化完成轉(zhuǎn)錄抑制可能通過以下3條途徑完成：①直接屏蔽轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)；②募集轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)阻遏蛋白；③改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，抑制基因表達(dá)[11]。近些年來，隨著基因芯片技術(shù)及高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)人全基因組甲基化譜的研究逐年增多，涉及多個(gè)領(lǐng)域范圍，這些研究大大提高了人類對(duì)DNA甲基化在疾病中整體影響的認(rèn)識(shí)。

二、 DNA甲基化及肺血管重塑與PAH的關(guān)系

DNA甲基化可以調(diào)節(jié)某些被甲基化區(qū)域的基因表達(dá)和血管平滑肌細(xì)胞的分化從而促使PAH的形成[12]。PAH的致病基因活化素受體類激酶1（ACVRL1/ALK1）的表達(dá)主要集中于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，并受CpG島甲基化控制，介導(dǎo)ACVRL1/ALK1啟動(dòng)子區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子Sp1[13]。持續(xù)性血管收縮和血管重塑是PAH的兩個(gè)重要的病理變化。有學(xué)者證實(shí)，具有強(qiáng)烈血管收縮功能的內(nèi)皮素-1受人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）調(diào)控，在低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈小鼠模型中，IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域有一個(gè)特定的胞嘧啶甲基化位點(diǎn)是對(duì)缺氧作出反應(yīng)的，因此推測(cè)IGF-1基因甲基化可能調(diào)控內(nèi)皮素-1形成從而對(duì)小鼠PAH形成發(fā)揮作用[14]。不同刺激（如受傷和缺氧）會(huì)導(dǎo)致肺動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)和功能上的改變，隨后引起細(xì)胞存活和凋亡之間的不平衡，從而引發(fā)了肺血管的重塑，超氧歧化酶2（SOD2）啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化引起氧化還原反應(yīng)信號(hào)通路受損，從而造成肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）的增殖與凋亡抵抗，最終引發(fā)PAH[15-16]。肺動(dòng)脈壓力的增加伴隨著肺血管重塑的不斷增加，DNA甲基化參與調(diào)控PAH的肺血管重塑。

三、 相關(guān)基因甲基化與PAH的關(guān)系

1.編碼SOD2基因

SOD2基因編碼線粒體中的SOD。SOD2是一種由過氧化氫（H2O2）參與監(jiān)管的酶，與低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）相互作用，也有腫瘤抑制基因的作用[17]。在SOD2介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和凋亡中，PASMC受到影響，首先在fawn-hooded大鼠模型和IPAH患者中被證實(shí)，而在人PAH中，肺動(dòng)脈和從狀病變中發(fā)現(xiàn)SOD2的缺乏[18]。Archer等[16]證實(shí)在自發(fā)性PAH的fawn-hooded大鼠模型和人高度增殖的平滑肌細(xì)胞中SOD2基因表達(dá)下降，導(dǎo)致線粒體低極化，引起氧化還原反應(yīng)信號(hào)通路受損，損害了機(jī)體氧化應(yīng)激信號(hào)通路，激活HIF-1α，使得PASMC過度增生，調(diào)亡抵抗，從而誘發(fā)PAH，且SOD2表達(dá)的下降主要是通過SOD2啟動(dòng)子區(qū)域CpG島DNA甲基化引起SOD2基因轉(zhuǎn)錄抑制所致。調(diào)節(jié)5-氮雜胞苷（甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑）逆轉(zhuǎn)了甲基化和增加了SOD2的表達(dá)。隨后fawn-hooded大鼠模型中增加SOD2降低了平均肺動(dòng)脈壓力和動(dòng)脈厚度。這些發(fā)現(xiàn)清晰地凸顯了通過SOD2和HIF-1α致使PASMC增殖的表觀遺傳通路，并為PAH的治療提供了新的靶點(diǎn)。

2.IGF-1基因表達(dá)

Perkett通過對(duì)山羊持續(xù)性空氣栓塞12 d形成PAH模型，發(fā)現(xiàn)IGF-1在第2日時(shí)顯著升高，并在12 d中持續(xù)升高[19]。IGF-1對(duì)肺血管平滑肌細(xì)胞有促進(jìn)其增殖的作用，并促使肺血管重塑，在低氧刺激下，IGF-1信號(hào)在肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞呈激活狀態(tài)，IGF-1參與低氧性肺血管重塑，以內(nèi)分泌和自分泌/旁分泌方式刺激血管平滑肌細(xì)胞增生肥厚[20-21]。IGF-1基因的mRNA表達(dá)與DNA甲基化及組蛋白修飾關(guān)聯(lián)密切，其通過調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮素-1而發(fā)揮作用，組蛋白脫乙酰酶（HDACs）調(diào)節(jié)IGF-1的表達(dá)。Zhao等[22]研究證實(shí)，HDAC1和HDAC5的水平在2組PAH患者和一組PAH大鼠模型中均高于對(duì)照組，并證實(shí)組蛋白乙?；谋碛^遺傳學(xué)修飾與PAH的發(fā)生發(fā)展有關(guān)系，而HDACs抑制劑可以對(duì)上述大鼠模型的PAH發(fā)生逆轉(zhuǎn)。另外，Yang等[14]通過對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)性研究發(fā)現(xiàn)，HDACs抑制劑抑制的HDACs將減少新生小鼠肺內(nèi)低氧誘導(dǎo)的DNA甲基化總體水平和肺內(nèi)IGF-1啟動(dòng)子區(qū)域周圍的胞嘧啶甲基化水平。但是國內(nèi)外關(guān)于HDACs抑制劑通過影響DNA甲基化從而影響IGF-1基因表達(dá)，致使PAH進(jìn)一步發(fā)展的研究并不多，這可能是未來研究的一個(gè)新方向。

3.腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）

ABCA1是具有跨膜結(jié)構(gòu)域的對(duì)稱結(jié)構(gòu)，近幾年，對(duì)于ABCA1的研究是國內(nèi)外的熱點(diǎn)。其在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及高密度脂蛋白代謝過程中發(fā)揮重要作用，國外學(xué)者證實(shí)ABCA1 DNA甲基化抑制了ABCA1的表達(dá)，造成體內(nèi)膽固醇大量蓄積[23]。膽固醇在肺血管內(nèi)積聚造成肺血管增粗，可能會(huì)引起PAH，國內(nèi)有學(xué)者證實(shí)他汀類藥物對(duì)PAH有治療作用，從側(cè)面證實(shí)了這一點(diǎn)[24]。炎癥作用是PAH的發(fā)病機(jī)制之一，另外IL-8等炎癥因子可參與血管重構(gòu)和血管新生，使得PAH進(jìn)一步進(jìn)展[25]。在肺內(nèi)ABCA1蛋白的表達(dá)與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，ABCA1介導(dǎo)的膽固醇運(yùn)輸活動(dòng)與ABCA1抗炎活性有關(guān)[26]。炎癥反應(yīng)本身就是PAH的一個(gè)發(fā)病因素。國外學(xué)者實(shí)驗(yàn)證明，PAH肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中ABCA1基因啟動(dòng)子序列與正常人相比呈高甲基化狀態(tài)[19]。

4.與PAH有關(guān)的其他基因

除了以上3中研究較多的基因外，國內(nèi)外報(bào)道較多的與PAH形成及發(fā)展有關(guān)的基因包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因、5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因等，另外，PAH中，小窩蛋白、酸敏感鉀離子通道蛋白3、SMAD9基因的突變已被證實(shí)，而這些基因的甲基化或多個(gè)基因表達(dá)水平協(xié)同作用可能都會(huì)導(dǎo)致PAH形成。

5.與PAH患病相關(guān)的基因

筆者收集了6例PAH和6名正常人作預(yù)實(shí)驗(yàn)，其中，病例組1包括4例可逆病人，病例組2包括2例不可逆病人。通過病例組1與對(duì)照組的比較，調(diào)整P值具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的有4個(gè)基因。通過病例組2與對(duì)照組的比較，調(diào)整P值<0.05的有6個(gè)基因。2個(gè)病例組相比較，我們發(fā)現(xiàn)了16個(gè)調(diào)整P值<0.05的基因。之后，我們?cè)谟薪y(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因中篩選出位于編碼區(qū)或者UTR區(qū)（非編碼區(qū)）的候選基因，它們分別是：ABCA6（17q24.3），C13orf28（13q34），MMP27（11q24），COPB1（11p15.2），HLA-DRB6（6p21.3），HLA-DRB1（6p21.3），HLA-DRB5（6p21.3）[27]。這有助于說明肺動(dòng)脈高壓與基因位點(diǎn)的甲基化有著密切關(guān)聯(lián)。

四、 總結(jié)與展望

大量研究結(jié)果表明，PAH的發(fā)生是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，而表觀遺傳學(xué)正是從遺傳-環(huán)境相互作用的角度來探討疾病的發(fā)生。目前越來越多的證據(jù)表明表觀遺傳學(xué)機(jī)制參與PAH的形成及發(fā)展，而DNA甲基化是主要的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制之一，其對(duì)PAH影響的研究還處于初步階段，在PAH領(lǐng)域中，亟需開展表觀遺傳學(xué)方面的研究。哪一些基因甲基化影響PAH，這些相關(guān)基因在什么時(shí)候發(fā)生甲基化，DNMT如何識(shí)別基因甲基化位點(diǎn)等等還需要更進(jìn)一步深入研究。隨著對(duì)PAH患者或動(dòng)物模型的相關(guān)基因的差異甲基化和外周血全基因組的甲基化譜的進(jìn)一步研究，將有助于我們對(duì)PAH發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識(shí)，并為PAH的治療提供新的靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2017-10-06）

（本文編輯：楊江瑜）