續(xù)文君 宋向東 黃鑫 梁劍平 張嘉男 高艷 程青芳 郝寶成

摘要：【目的】評估恩拉霉素對大鼠的慢性毒性作用，為其科學合理使用提供依據(jù)?！痉椒ā窟x用240只SPF級Wistar大鼠為試驗動物進行恩拉霉素的慢性毒性試驗，根據(jù)其半數(shù)致死劑量（LD50）分別設高劑量組（1000 mg/kg）、中劑量組（200 mg/kg）、低劑量組（10 mg/kg）及空白對照組，按高、中、低劑量分別將恩拉霉素添加至大鼠飼料中加工成定制飼料，每天飼喂1次，連續(xù)飼喂6個月，通過臨床觀察、血液學分析、血清生化檢測、臟器系數(shù)和病理學檢查等評估恩拉霉素對大鼠的慢性毒性作用?！窘Y(jié)果】在整個試驗周期（6個月）內(nèi)，各恩拉霉素劑量組的大鼠飲食飲水、大小便均正常，精神狀況良好，被毛光澤，未出現(xiàn)死亡。與對照組相比，各恩拉霉素劑量組大鼠體重均無顯著變化（P>0.05，下同）；隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，恩拉霉素僅對大鼠中性粒細胞數(shù)有一定影響，對堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及白蛋白等血清生化指標有輕微影響。在臟器系數(shù)方面，連續(xù)給藥6個月后，僅高劑量組大鼠肝臟和脾臟的臟器系數(shù)較對照組顯著降低（P<0.05），其他的臟器系數(shù)均無顯著變化。隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，恩拉霉素對大鼠的肝臟、肺臟、腎臟和心臟等器官組織會產(chǎn)生輕微影響，主要表現(xiàn)為：高劑量組大鼠肝臟組織中央靜脈周圍的細胞呈輕微腫脹；肺臟組織有一定程度的淤血，肺間質(zhì)輕微增寬；腎臟組織輕微充血，且腎小管上皮細胞輕微腫脹；心肌纖維輕度萎縮，心肌間質(zhì)增寬?！窘Y(jié)論】恩拉霉素的毒性極低，隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，其對大鼠的慢性毒性作用非常輕微，即恩拉霉素的臨床用藥安全性極高。

關(guān)鍵詞： 大鼠；恩拉霉素；慢性毒性；臟器系數(shù)；組織病理變化

中圖分類號： S859.796 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）05-1008-08

Abstract：【Objective】The study aimed to evaluate the chronic toxicity of enramycin on rats and provide scientific basis for its rational use. 【Method】A total of 240 SPF-grade Wistar rats were selected to test the chronic toxicity of enramycin. High-dose group（1000 mg/kg）， medium-dose group（200 mg/kg）， low-dose group（10 mg/kg） and blank control group were divided according to enramycin half lethal dose（LD50）. Enramycin was added to rat feedstuff in high， medium and low doses to be processed into customized feedstuff. The rats were fed once a day， continuously fed for six months. Then， the chronic toxicity of enramycin in rats was evaluated through clinical observations， hematology analysis， blood serum biochemical examination， organ coefficient and pathological examination. 【Result】During the entire test period （six months）， rats in every treatment group were normal in drinking and urination， and were in good spirits with glossy coat， no rat was dead. Compared with the control group， there was no significant change in the body weight of each enramycin dose group（P>0.05， the same below）. With the increase of drug dosage and prolongation of administration time， enramycin only had certain effects on the number of neutrophils in rats， and it slightly affected blood serum indexes of alkaline phosphatase， aspartate aminotransferase and albumin. In terms of organ coefficient， only six months after continuous medication， the organ coefficients of liver and spleen only in high-dose group rats was significantly lower than that of the control group（P<0.05）， and there was no significant change in other organ coefficients. With the increase of drug dose and prolongation of administration time， enramycin slightly affected the liver， lung， kidney and heart of rats. The main manifestations were： in high-dose group， the cells around its central vein of liver tissue were slightly swollen； lung tissue had certain degree of congestion， and the interstitial space was slightly widened； renal tissue was slightly congested， and renal tubular epithelial cells were slightly swollen； myocardial fibers were slightly atrophied， and myocardial interstitials were widened. 【Conclution】Enramycin has very low toxicity. With increase of drug dosage and prolongation of medication time， its chronic toxicity effects on rat is very slight， that is， the safety of enramycin in clinical medication is very high.

Key words： rat； enramycin； chronic toxicity； organ coefficient； histopathological change

0 引言

【研究意義】恩拉霉素（Enramycin）又稱安來霉素、恩來霉素等，是由微生物發(fā)酵而來的一種多肽類抗生素，于1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會社研發(fā)，1993年日本武田藥品工業(yè)株式會社向我國農(nóng)業(yè)部申請登記注冊該藥（卜仕金，2003）。恩拉霉素具有較強的抑制革蘭氏陽性菌作用，尤其對腸道有害菌的抑制力很強，且長期使用后不易產(chǎn)生耐藥性，被世界上很多國家推薦作為動物促生長劑，是一種理想的飼料添加劑（陳洪等，2010；高艷江和張勇，2010；葉婷婷等，2011），但長期大量使用也會給生態(tài)環(huán)境造成一定影響。因此，有必要探究恩拉霉素是否具有潛在的遲發(fā)毒性作用，進一步評價其安全性。【前人研究進展】急性毒性試驗已證實，恩拉霉素經(jīng)口服、皮下或肌肉注射給藥時實際無毒。其中，大鼠和小鼠口服恩拉霉素的半數(shù)致死劑量（LD50）均高于10.0 g/kg，而皮下或肌肉注射的LD50均高于5.0 g/kg；腹腔注射的LD50：小鼠750.0～830.0 mg/kg，大鼠830.0～910.0 mg/kg；靜脈注射的LD50：小鼠30.0～31.2 mg/kg，大鼠66.0～77.0 mg/kg（卜仕金，2003）。張勇等（2010）通過肉雞飼喂恩拉霉素試驗，發(fā)現(xiàn)恩拉霉素對肉雞小腸絨毛形態(tài)的影響極其明顯，且對小腸形態(tài)有良好的改善作用。李勤等（2013）研究表明，恩拉霉素可顯著提高斷奶仔兔的生產(chǎn)性能，減少其腹瀉發(fā)病率及降低死亡率。Martín等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，于肉雞飼料中添加恩拉霉素可有效促進肉雞的生長。近年來，關(guān)于高產(chǎn)恩拉霉素菌株的研究較多，證實采用紫外誘變選育的恩拉霉素高產(chǎn)菌株產(chǎn)素水平穩(wěn)定（王建玲等，2015）；離子注入誘變也是一種獲得高產(chǎn)恩拉霉素變異菌株的有效方法（蔡作新等，2015；丁志雯等，2016）；而以20%油酸乙酯、40%聚氧乙烯氫化蓖麻油和40%丙二醇組成的恩拉霉素自微乳制劑質(zhì)量穩(wěn)定，有望改善其生物利用度（陳浩等，2016）。此外，針對恩拉霉素的生物檢測方法得到有效改進，其中以干燥濾紙片法的操作最簡單快捷，可實現(xiàn)大批量樣品同時檢測，具有極高的實用價值（許銘玉等，2017）?！颈狙芯壳腥朦c】至今，有關(guān)恩拉霉素對大鼠慢性毒性的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】將不同劑量的恩拉霉素添加至大鼠飼料中，連續(xù)飼喂6個月，通過臨床觀察、血液學分析、血清生化檢測、臟器系數(shù)和病理學檢查等評估恩拉霉素對大鼠的慢性毒性作用，為該藥科學合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

恩拉霉素原料藥（恩拉霉素含量11.58%）由石家莊高科動物保健品有限公司生產(chǎn)提供，生產(chǎn)批號2016-098。SPF級Wistar大鼠240只，購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心，體重50.0～70.0 g/只，雌（♀）雄（♂）各半，臨床檢查為健康大鼠。試驗大鼠購入后在實驗室條件下暫養(yǎng)觀察7 d，自由采食飲水。

1. 2 試驗分組與給藥

按《中國獸藥典》的相關(guān)規(guī)定要求，將240只大鼠隨機分成4組，每組60只，雌雄各半。設恩拉霉素LD50的1/10為高劑量組（1000 mg/kg）、1/50為中劑量組（200 mg/kg）、1/1000為低劑量組（10 mg/kg），并設未添加恩拉霉素的空白對照組。根據(jù)試驗設計，試驗前將其按高、中、低劑量分別添加至大鼠飼料中加工成定制飼料，每天飼喂1次，連續(xù)給藥6個月。試驗期間各處理組大鼠均自由飲水，自由采食（鄭筱萸，2002；費陳忠等，2013）。

1. 3 指標觀察

1. 3. 1 臨床癥狀與體質(zhì)量檢查 每天觀察試驗大鼠的飲食、精神狀態(tài)及行為活動，并記錄異常情況，每月對大鼠稱重1次，直至試驗結(jié)束。

1. 3. 2 血液學分析及血清生化學指標測定 于給藥3和6個月后分別對試驗大鼠進行心臟采血，借助相關(guān)儀器進行血液學分析和血清生化指標測定，檢驗項目包括紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）、血小板（PLT）和血紅蛋白含量（HGB）等常規(guī)指標及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白蛋白（ALB）、尿氮素（BUN）和肌酐（CREA）等生化指標。

1. 3. 3 主要臟器系數(shù)與組織病理學觀察 經(jīng)心臟采血后的試驗大鼠立即處死，取其心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟稱重，計算相對臟器系數(shù)。稱重后取各器官組織固定于10%甲醛溶液中，經(jīng)石蠟包埋、切片和HE染色，鏡檢觀察各器官組織的病理變化并拍照記錄。

1. 4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，其中大鼠增重、血常規(guī)血生化指標和臟器系數(shù)均進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 恩拉霉素對大鼠臨床癥狀及體質(zhì)量的影響

在整個試驗周期（6個月）內(nèi)，各恩拉霉素劑量組的大鼠飲食飲水、大小便均正常，精神狀態(tài)良好，被毛光澤，未出現(xiàn)死亡。與對照組相比，各恩拉霉素劑量組大鼠體質(zhì)量均無顯著變化（P>0.05，下同）（表1），即長期服用恩拉霉素對大鼠體質(zhì)量無明顯影響。

2. 2 恩拉霉素對大鼠血液生理指標的影響

與對照組相比，連續(xù)給藥3個月后，中、低劑量組大鼠的各項血液常規(guī)生理指標均無顯著變化，僅高劑量組雌性大鼠的中性粒細胞顯著下降（P<0.05，下同）；連續(xù)給藥6個月后，高、中劑量組雌性大鼠的中性粒細胞顯著升高，但白細胞、淋巴細胞比率和紅細胞等其他檢測項目無顯著變化（表2）。說明隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，恩拉霉素僅對大鼠中性粒細胞有一定影響。

2. 3 恩拉霉素對大鼠血清生化指標的影響

與對照組相比，連續(xù)給藥3個月后，中、低劑量組大鼠的各項血液生化指標均無顯著變化，僅高劑量組雌性大鼠的堿性磷酸酶活性顯著升高；連續(xù)給藥6個月后，高劑量組大鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著下降，高、中劑量組雌性大鼠的白蛋白含量顯著升高，其他檢測項目變化差異均不顯著（表3）。說明隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，恩拉霉素對大鼠堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及白蛋白等血清生化指標有輕微影響。

2. 4 恩拉霉素對大鼠臟器系數(shù)的影響

與對照組相比，連續(xù)給藥3個月后，除高劑量組雌性大鼠肝臟和脾臟、雄性大鼠肺臟的臟器系數(shù)有顯著變化外，其他的臟器系數(shù)均無顯著變化，中、低劑量組各器官組織的臟器系數(shù)也均無顯著變化；連續(xù)給藥6個月后，僅高劑量組雄性大鼠肝臟和脾臟的臟器系數(shù)較對照組顯著降低，其他的臟器系數(shù)均無顯著變化（表4）。說明恩拉霉素的毒性很低，但隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，其對大鼠肝臟、脾臟和肺臟會產(chǎn)生輕微影響。

2. 5 恩拉霉素對大鼠器官組織病理變化的影響

經(jīng)顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，對照組大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等臟器的組織結(jié)構(gòu)均正常。相對于對照組，恩拉霉素中、低劑量組大鼠的肝臟和肺臟組織未見異常，高劑量組大鼠的肝臟組織也基本正常，僅中央靜脈周圍的細胞呈輕微腫脹（圖1）；高劑量組大鼠肺臟組織有一定程度的淤血，肺間質(zhì)輕微增寬（圖2）；中劑量組大鼠的腎臟組織輕微充血，高劑量組的腎小管上皮細胞輕微腫脹（圖3）；高劑量組大鼠的心肌纖維輕度萎縮，心肌間質(zhì)增寬（圖4）；各劑量組大鼠的脾臟組織結(jié)構(gòu)均無異常變化（圖5）。說明隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，恩拉霉素對大鼠的肝臟、肺臟、腎臟和心臟組織會產(chǎn)生輕微影響，對脾臟組織則無明顯影響。

3 討論

慢性毒性試驗是藥物安全評價的主要內(nèi)容之一。本研究選用SPF級Wistar大鼠為試驗動物進行恩拉霉素慢性毒性試驗，觀察大鼠出現(xiàn)的毒性反應及其血液生理生化指標和器官組織病理變化，分析劑量—毒性效應，進一步驗證恩拉霉素是否具有潛在的遲發(fā)毒性作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連續(xù)6個月對大鼠進行給藥，各恩拉霉素劑量組大鼠的飲食飲水、大小便均正常，精神狀態(tài)良好，被毛光澤，未出現(xiàn)死亡。模型動物的體質(zhì)量變化是反映動物機體中毒效應和毒物毒性的最基本指標，而臟器系數(shù)是表征藥物作用靶器官的重要指標（郭志廷等，2012；劉書偉等，2016）。與對照組相比，各恩拉霉素劑量組大鼠體質(zhì)量均無顯著變化；連續(xù)給藥3個月后，除高劑量組大鼠肝臟、脾臟和肺臟的臟器系數(shù)有顯著變化外，其他的臟器系數(shù)均無顯著變化，中、低劑量組各器官組織的臟器系數(shù)也均無顯著變化；連續(xù)給藥6個月后，僅高劑量組大鼠肝臟和脾臟的臟器系數(shù)較對照組顯著降低，其他的臟器系數(shù)均無顯著變化。臟器系數(shù)雖然是藥物安全評價中的一項必需檢測指標，但不能依據(jù)臟器系數(shù)的變化推論靶器官一定出現(xiàn)病例變化（袁本利，2003；劉曉磊等，2013）。因此，必須輔以其他檢測指標，包括組織病理切片及血液生理生化指標等。

血液學及血清生化指標是毒理學研究常用測評指標，通過衡量機體血液成分在受試藥物作用下的改變情況，從而確定受試藥物的毒性作用（張橋，2000；劉霆等，2003）。本研究結(jié)果表明，連續(xù)給藥3個月后，恩拉霉素中、低劑量組大鼠的各項血液常規(guī)生理指標均無顯著變化，高劑量組僅中性粒細胞較對照組顯著下降，在血清生化指標方面也僅表現(xiàn)為高劑量組大鼠的堿性磷酸酶活性顯著升高；連續(xù)給藥6個月后，高、中劑量組大鼠的中性粒細胞較對照組顯著升高，而在血清生化指標方面，高劑量組大鼠的谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著下降，高、中劑量組雌性大鼠的白蛋白含量顯著升高，其他檢測指標變化差異均不顯著?？梢?，恩拉霉素的毒性極低，隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，僅對大鼠的部分血液常規(guī)生理指標和血清生化指標產(chǎn)生輕微影響，即臨床用藥安全性極高。

組織病理學檢查可更加直觀地反映藥物對靶器官的毒性作用，是藥物毒性對機體產(chǎn)生損傷的直接證據(jù)（張橋，2000；吳苑瀅等，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，恩拉霉素對大鼠的肝臟、肺臟、腎臟和心臟組織會產(chǎn)生輕微影響，主要表現(xiàn)為：高劑量組大鼠肝臟組織中央靜脈周圍的細胞呈輕微腫脹；肺臟組織有一定程度的淤血，肺間質(zhì)輕微增寬；腎臟組織輕微充血，且腎小管上皮細胞輕微腫脹；心肌纖維輕度萎縮，心肌間質(zhì)增寬。這與恩拉霉素對大鼠臟器系數(shù)及血液常規(guī)生理指標和血清生化指標的影響趨勢基本一致，進一步佐證恩拉霉素的毒性極低，臨床用藥安全性極高。

4 結(jié)論

恩拉霉素的毒性極低，隨著藥物劑量的增加及給藥時間的延長，其對大鼠的毒性慢性作用非常輕微，即恩拉霉素的臨床用藥安全性極高。

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（責任編輯 蘭宗寶）