毛亞平 馬瑩 卜俊玲 曾雯 郭娟 陳敏 黃璐琦

摘要 目的：利用土培植物進(jìn)行原位侵染獲得RNAi型丹參毛狀根，并對(duì)其干擾效果進(jìn)行研究。方法：利用轉(zhuǎn)化有目標(biāo)基因RNAi載體的發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)土壤中生長(zhǎng)的丹參幼苗根莖部分進(jìn)行侵染產(chǎn)生毛狀根，經(jīng)熒光顯微鏡鑒定陽(yáng)性毛狀根，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)情況。結(jié)果：在土培丹參根莖部分成功侵染產(chǎn)生毛狀根，利用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)顯示目標(biāo)基因RNAi型毛狀根陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為72.72%，RNAi空載毛狀根陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為66.67%。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明RNAi型毛狀根中目標(biāo)基因表達(dá)受到抑制，表達(dá)量下降到空載型對(duì)照組的8.61%，證明對(duì)土培植物直接進(jìn)行侵染能夠成功誘導(dǎo)RNAi毛狀根。結(jié)論：采用原位侵染法誘導(dǎo)丹參根莖部位成功產(chǎn)生陽(yáng)性RNAi型毛狀根，侵染過(guò)程無(wú)需無(wú)菌操作，簡(jiǎn)單快捷，對(duì)植株生長(zhǎng)無(wú)影響，能夠用于功能基因的體內(nèi)功能研究。

關(guān)鍵詞 丹參；毛狀根；原位侵染；RNAi

Abstract Objective：To study the jamming effects of RNAi hairy roots of Salvia Miltiorrhiza by in situ infection of soil cultivating plants.Methods：Hairy roots were induced by infection of Agrobacterium rhizogenes transformed with the RNAi vector of target gene into the roots of Salvia Miltiorrhiza which were planted in the soil.Positive hairy roots were identified by fluorescence microscope.The expression of target gene was detected by qRT-PCR analysis.Results：Hairy roots were induced from the roots of Salvia Miltiorrhiza successfully.GFP detection results showed that positive conversion rates of hairy root lines of target gene RNAi and empty vector were 72.72% and 66.7%，respectively.qRT-PCR analysis revealed that the expression of target gene in RNAi hairy roots was significantly decreased to 8.61% compared with empty vector，which indicated that RNAi hairy roots were successfully induced from the soil planted Salvia Miltiorrhiza by in situ infection.Conclusion：Positive target gene-RNAi Salvia Miltiorrhiza hairy roots were successfully induced from the soil planted Salvia Miltiorrhiza by in situ infection.As the infection required no sterile operation，it was not only simple and quick，but also would not affect plant growth and development.It can be applicable to functional characterization of gene in vivo.

Key Words Salvia Miltiorrhiza； Hairy root； In situ infection； RNAi

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.02.004

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge.）的干燥根及根莖，丹參中脂溶性的丹參酮類化合物（Tanshinones）具有抗血栓、抗肝纖維化、抗炎、抗菌以及抗腫瘤等生物活性[1-3]。解析丹參酮生物合成途徑，并利用代謝工程的手段來(lái)調(diào)節(jié)丹參酮的含量對(duì)中藥資源的可持續(xù)利用和發(fā)展具有重大的意義。

藥用植物活性成分生物合成途徑解析成為近5年中藥研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一，對(duì)候選基因進(jìn)行功能研究是生物合成途徑解析的關(guān)鍵?；蚬δ苎芯堪w外功能研究和體內(nèi)功能研究，體外酶促反應(yīng)是植物基因驗(yàn)證功能的重要手段之一，具有快捷、方便的優(yōu)點(diǎn)，但體外酶促反應(yīng)會(huì)受到底物不明確，底物量不足等因素限制。植物具有極其復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致其次生代謝物的積累會(huì)受到眾多因素的影響，如催化合成產(chǎn)物的功能基因，代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子，中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)酶和植物自身受到來(lái)自外界化學(xué)和生物刺激等，都會(huì)影響代謝產(chǎn)物的合成和積累。因此，為了更加明確基因在植物代謝網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的功能和作用，其催化功能在植物體外由原核、真核表達(dá)及體外酶促等手段經(jīng)過(guò)驗(yàn)證后還需要在植物體內(nèi)對(duì)基因的功能進(jìn)行研究。

利用葉盤(pán)法產(chǎn)生RNAi（RNA Interference）毛狀根是藥用植物基因功能研究的重要方法之一，該方法主要利用轉(zhuǎn)化有目標(biāo)基因RNAi載體的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染外植體，產(chǎn)生RNAi型毛狀根。該系統(tǒng)具有生長(zhǎng)速度快，周期短，穩(wěn)定遺傳，不需要外源植物激素等優(yōu)點(diǎn)，是基因體內(nèi)驗(yàn)證研究的常用方法。Cheng等[4]利用該技術(shù)對(duì)丹參酮生物合成途徑的萜類合酶基因SmCPS進(jìn)行干擾后發(fā)現(xiàn)丹參酮IIA等有效成分的含量顯著降低。Ma等[5]構(gòu)建了丹參CYP76AH1的RNAi毛狀根體系，CYP76AH1-RNAi型毛狀根系中底物次丹參酮二烯含量的顯著上升和產(chǎn)物鐵銹醇含量的顯著下降揭示了CYP76AH1在丹參植物體內(nèi)的催化功能，下游途徑中4個(gè)主要丹參酮類化合物含量的顯著下降驗(yàn)證了CYP76AH1在丹參酮類化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵作用。研究表明，利用葉盤(pán)法進(jìn)行RNAi毛狀根誘導(dǎo)能夠有效抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物發(fā)生變化，從而驗(yàn)證基因在植物體內(nèi)的功能。

然而葉盤(pán)法誘導(dǎo)需要經(jīng)歷預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、愈傷形成等過(guò)程，誘導(dǎo)周期長(zhǎng)并且毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化需要在無(wú)菌的環(huán)境中進(jìn)行，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。而對(duì)土培植物直接進(jìn)行侵染誘導(dǎo)出毛狀根相比之下更為簡(jiǎn)便，通過(guò)在組織上劃出傷口，將發(fā)根農(nóng)桿菌直接接種在傷口處，共培養(yǎng)一段時(shí)間后，在植株接種部位能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根。該方法已經(jīng)成功應(yīng)用在烏拉爾甘草和桑樹(shù)等藥用植物研究中[6-7]。本研究擬在重要藥用植物丹參中建立原位毛狀根侵染誘導(dǎo)體系，以丹參酮生物合成途徑重要修飾酶基因CYP76AH1為目的基因[8]，構(gòu)建RNAi載體，轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌，侵染土培丹參植株的根莖部位，得到既含有丹參自身主根、須根，又含有目的基因RNAi片段轉(zhuǎn)基因毛狀根的復(fù)合型丹參植株，利用綠色熒光蛋白篩選轉(zhuǎn)化毛狀根以用于基因表達(dá)和代謝物譜分析。通過(guò)建立丹參毛狀根的原位侵染誘導(dǎo)的方法，為丹參酮下游基因功能研究提供新方法。

1 材料

1.1 藥物 植物材料唇形科鼠尾草屬植物紫花丹參（Salvia miltiorrhiza）。實(shí)驗(yàn)材料為發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）誘導(dǎo)此丹參生成的毛狀根。菌株和載體發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，植物RNAi表達(dá)載體pK7WIWG2D為本實(shí)驗(yàn)室保存載體，pK7GWIWG2D-AH1為實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建載體[5]。

1.2 試劑與儀器 PrimeScriptTM-RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time），SYBRPremix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)）；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)）；所用引物均由生工生物工程（上海）有限公司生產(chǎn)合成。實(shí)驗(yàn)儀器LightCycler 480II高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)（Roche Applied Science）；680X凝膠成像分析系統(tǒng)（基因有限公司）；Axio Scope A1熒光顯微鏡（Zeiss）。

1.3 方法

1.3.1 土培丹參原位毛狀根誘導(dǎo) 取播種后40～60 d的丹參幼苗，利用注射器針頭在主根上部和根莖處輕劃形成傷口，用注射器分別吸取含有野生型發(fā)根農(nóng)桿菌、轉(zhuǎn)化有RNAi空載體pK7WIWG2D和pK7GWIWG2D-AH1表達(dá)載體的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液侵染損傷部位后浸潤(rùn)1～2 h[9]，在損傷部位周?chē)胖?層大小足以覆蓋至花盆邊緣的錫箔紙，防止毛狀根與丹參自身主根、須根混雜，在錫箔紙上方蓋好土壤，進(jìn)行毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)。

1.3.2 毛狀根熒光顯微鑒定 將傷口處長(zhǎng)出的毛狀根尖切下1 cm左右大小制片后，于倒置熒光顯微鏡藍(lán)色激發(fā)光源下觀察，按照公式計(jì)算轉(zhuǎn)化率。

1.3.3 測(cè)定干擾毛狀根基因表達(dá)量 利用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取丹參毛狀根總RNA。NANO Drop核酸定量?jī)x測(cè)定RNA濃度后，反轉(zhuǎn)錄成總cDNA。利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物，以cDNA為模板，以野生型、空載型為對(duì)照，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RNAi毛狀根中CYP76AH1基因的相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1 CYP76AH1-RNAi型毛狀根產(chǎn)生 前期研究表明，pK7GWIWG2D-AH1載體能夠成功抑制RNAi毛狀根中CYP76AH1的表達(dá)，并對(duì)代謝產(chǎn)物的積累產(chǎn)生影響[5]。本研究中利用轉(zhuǎn)化有pK7GWIWG2D-AH1載體的發(fā)根農(nóng)桿菌直接侵染土培丹參的根以及根莖部位，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)，約15 d后在主根上部和根莖傷口處生長(zhǎng)出透明毛狀根，植株被侵染過(guò)后其生長(zhǎng)并沒(méi)有受到影響。毛狀根在主根上部和根莖傷口部位發(fā)出，主要在錫箔紙的上層貼近生長(zhǎng)，約30 d后即獲得大量的CYP76AH1-RNAi型毛狀根。見(jiàn)圖1。

2.2 毛狀根誘導(dǎo)率檢測(cè) 取被侵染丹參的錫箔紙以上部分的毛狀根于倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)，可以觀察到轉(zhuǎn)化RNAi空載體（圖2A，2B）與目的基因CYP76AH1干擾載體（圖2C，2D）的丹參毛狀根在藍(lán)色（450～490 nm）激發(fā)光下會(huì)發(fā)射出穩(wěn)定的綠色熒光（520 nm），而利用野生型發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1侵染產(chǎn)生的毛狀根（圖2E，2F）僅在自然光下可見(jiàn)，在藍(lán)色激發(fā)光下無(wú)熒光。通過(guò)GFP檢測(cè)對(duì)其陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以及計(jì)算，顯示CYP76AH1-RNAi型毛狀根陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為72.72%，空載型毛狀根陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率為66.67%。

2.3 CYP76AH1-RNAi型毛狀根基因表達(dá)量檢測(cè) 選擇生長(zhǎng)狀況大致相同的丹參野生型、空載型和CYP76AH1-RNAi型毛狀根提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。見(jiàn)圖3。

對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行歸一化處理后進(jìn)行差異顯著性分析，分析結(jié)果顯示野生型和空載型毛狀根之間沒(méi)有顯著性差異，CYP76AH1-RNAi型毛狀根中目標(biāo)基因CYP76AH1表達(dá)量顯著下降至空載型毛狀根的8.61%，證明原位侵染法誘導(dǎo)丹參毛狀根體系構(gòu)建成功，其干擾效果明顯。見(jiàn)圖4。

3 討論

RNAi技術(shù)通過(guò)抑制目的基因的表達(dá)，導(dǎo)致代謝物積累發(fā)生改變，從而驗(yàn)證目的基因在植物復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)中的作用。在本研究中利用原位侵染法以發(fā)根農(nóng)桿菌侵染土培丹參植株產(chǎn)生毛狀根，以丹參酮生物合成途徑中第一個(gè)P450基因CYP76AH1為目的基因進(jìn)行方法研究。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，CYP76AH1-RNAi型丹參毛狀根中CYP76AH1基因表達(dá)量顯著低于野生型、空載型毛狀根，說(shuō)明該體系對(duì)目標(biāo)基因具有較好的干擾效果，可以用于丹參酮生物合成途徑其他基因的功能研究。

目前發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法有3種。外植體接種法嚴(yán)格要求無(wú)菌環(huán)境且耗時(shí)較長(zhǎng)，原生質(zhì)體共培養(yǎng)法則要求原生質(zhì)體具有較高的再生率，植物體原位侵染法最為省時(shí)簡(jiǎn)便[10]。在土培植物上采用原位侵染法誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根，在植株自身生長(zhǎng)的自然環(huán)境下即可利用發(fā)根農(nóng)桿菌進(jìn)行侵染操作，不要求嚴(yán)格的無(wú)菌環(huán)境下，侵染過(guò)后植株生長(zhǎng)情況正常，1個(gè)月左右便能產(chǎn)生足夠的毛狀根用于基因表達(dá)和代謝物分析，誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根具有較高的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率并且能有效地對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行干擾。整個(gè)體系建立的過(guò)程省時(shí)、簡(jiǎn)單且便于操作、侵染過(guò)程無(wú)需無(wú)菌操作，極大地提高了實(shí)驗(yàn)效率?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，直接侵染法作為一種構(gòu)建RNAi型毛狀根體系的有效方法，可應(yīng)用到根系藥用植物例如人參、三七等植物次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑功能基因的挖掘和功能研究中。

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