宋蓮 楊俊旭 劉丹 李枝林 王玉英

摘 要： 該研究以墨蘭‘綠墨素（Cymbidium sinense ‘Lv mosu）和大花蕙蘭‘世界和平（Cymbidium hybridum ‘Shijieheping）雜交蘭F1代原球莖為材料，采用浸泡法研究不同濃度秋水仙素和不同處理時間誘導(dǎo)植株加倍的效果。結(jié)果表明：0.03%秋水仙素處理72 h，誘導(dǎo)變異率為36%，死亡率為36%，誘導(dǎo)效果最佳；多倍體植株與二倍體植株相比，表現(xiàn)為植株根部木質(zhì)化加劇，植株矮壯，葉色深綠，葉片變厚、變寬，葉面粗糙，少部分有雙葉脈、葉尖開裂、葉片扭曲，生長緩慢等；且多倍體植株氣孔大，氣孔密度減小；經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，二倍體墨蘭 × 大花蕙蘭F1代植株的熒光通道值為88，多倍體植株熒光通道值是176，多倍體植株為四倍體。該研究結(jié)果為培育蘭花新品種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 墨蘭‘綠墨素 × 大花蕙蘭‘世界和平F1代， 原球莖， 秋水仙素， 多倍體誘導(dǎo)

中圖分類號： Q949.9， Q321

文獻標(biāo)識碼： A

文章編號： 1000-3142（2018）02-0188-07

Polyploid induction in Cymbidium sinenthese ‘Lv mosu× Cymbidium hybridum‘Shijieheping F1 generation

SONG Lian， Yang Junxu， LIU Dan， LI Zhilin， WANG Yuying*

（ Institute of Landscape Plants， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China ）

Abstract： Technique of mutation breeding in protocorm of Cymbidium sinense ‘Lv mosu× C.hybridum ‘Shijieheping F1 generation of hybrids was studied by means of tissue culture and chemical mutagenesis. The results showed that 0.03% colchicine treatment for 72 h， induced mutation rate was 36%， the mortality rate of 36%， the induced effect was the best； the polyploidy plant had more lignified roots than the diploid plants， the plants were dwarfed， the veins， leaves were dark green， the leaves were thickened and broadened， rough and double leaf twist， slow growth and so on， while the stomata and guard cells were larger and the stomatal density was decreased. DNA ploidy was analyzed by flow cytometry and the values of fluorescence channel were 88 in diploid plants and 176 in polyploid plants， the polyploid plants were tetraploid.

Key words： Cymbidium sinense ‘Lv mosu× Cymbidium hybridum‘Shijieheping F1 generation， protocorm， colchicine， polyploidy induction

墨蘭（Cymbidium sinense）因其多在春節(jié)前后開放，又名入歲蘭、報歲蘭、豐歲蘭或拜歲蘭，是我國傳統(tǒng)蘭花之一，有“花中四君子”之一的美稱，在國蘭中花枝最高、株型最大。由于其花瓣香氣濃郁，色彩清脆如玉，葉片獨特飄逸，象征著幽芳高潔的情操，所以倍受廣大花卉愛好者青睞，是傳統(tǒng)迎春年花佳品之一。大花蕙蘭（ C. hybridum）又名虎頭蘭、蟬蘭、東亞蘭、新美娘和喜姆比蘭，由于與蕙蘭（C. faberi）較相似且花朵碩大（錢張，2007），有重要的經(jīng)濟價值和觀賞價值而命名為大花蕙蘭，現(xiàn)已成為五大盆栽蘭花（大花蕙蘭、 蝴蝶蘭、 石斛蘭、 卡特蘭、 中國蘭）之一，是重要的切花蘭花種類之一（張宇歡等，2016），也是四大年宵盆花（蝴蝶蘭、大花蕙蘭、紅掌和鳳梨）之一（馮秋霞和王慶平，2007），享有“蘭花皇后”的美譽。在蘭屬花卉觀賞方面，人們對其優(yōu)良性狀的要求不斷提高，只有通過多途徑新種質(zhì)創(chuàng)制技術(shù)，研究培育出新品種花卉，才能滿足市場需求。利用傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)，獲得墨蘭×大花蕙蘭 F1代植株，以期選育出具有國蘭的香和洋蘭的艷的蘭花新品系（張宇歡等，2016）；同時通過化學(xué)方法進行多倍體誘導(dǎo)，擬獲得具有花大、抗性強等特點的株系，豐富新種質(zhì)類型，為蘭花新品種選育奠定基礎(chǔ)。

近年來，通過多倍體育種技術(shù)，相繼獲得了多種花卉新品種。多倍體植物具有較高抗性、葉片肥厚、花色艷麗、花期長、花瓣多等特點，具備新奇變異特性，觀賞價值普遍提高，在花卉育種中，是不可或缺的種質(zhì)資源。目前通過人工加倍技術(shù)獲得多倍體已在甜菊、百合、 黨參枸杞、 丹參、 川白芷、牽牛屬、金魚草屬和雞冠花等植物上獲得成功（詹忠根和徐程，2011；張曉曼等，2004）。關(guān)于蘭屬多倍體誘導(dǎo)有春蘭（林芬和鄧國礎(chǔ)，1997）、沉香虎頭蘭（李涵等，2005）、墨蘭×大花蕙蘭的 F1代（張志勝等，2005）、素心黃（鄧櫻等，2008）等染色體加倍的報道。但尚未見有秋水仙素對墨蘭‘綠墨素和大花蕙蘭‘世界和平F1代多倍體誘導(dǎo)研究報道。本研究在已建立的墨蘭‘綠墨素和大花蕙蘭‘世界和平F1代再生體系基礎(chǔ)上，以其無菌原球莖為材料，采用組織培養(yǎng)結(jié)合秋水仙素誘導(dǎo)的方法，旨在為培育蘭花新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

墨蘭×大花蕙蘭F1代組培原球莖由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)花卉研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 多倍體誘導(dǎo) 在無菌條件下，選擇轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20 d增殖的原球莖，將其切成面積約為1 cm2塊狀，浸泡在于濃度為0、0.03%、0.05%、0.10%的秋水仙素溶液中，分別處理24 h、48 h和72 h后用無菌水沖洗3～4次，用濾紙吸干水轉(zhuǎn)接到1/2MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+80 g·L-1香蕉泥培養(yǎng)基上。40 d觀察苗體的死亡情況，90 d 觀察苗體的變異情況，并統(tǒng)計出與二倍體植株外觀形態(tài)差異植株數(shù)量。培養(yǎng)條件：光照強度為1 000～1 800 lx，光照時間為12～14 h·d-1；溫度為22～26 ℃；pH為5.8。

1.2.2 多倍體分化培養(yǎng) 將植株外觀形態(tài)變異植株，接入1/2MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1+80 g·L-1香蕉泥增殖培養(yǎng)基中進行3～5次繼代分化培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光照強度為1 000～1 800 lx，光照時間為12～14 h·d-1，溫度為22～26 ℃，pH為5.8。

1.2.3 多倍體鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 以已知二倍體形態(tài)為參照，觀察記錄變異植株株高、葉片顏色、葉形等相關(guān)數(shù)據(jù)。所選測量植株均有4片完全展開的葉片，取植株基部數(shù)起第3片葉為測量對象。用電子數(shù)顯卡尺對植株的葉長、葉寬和株高進行測量。二倍體和變異植株各檢測20株。

1.2.3.2 氣孔鑒定 植物保衛(wèi)細(xì)胞的長度是鑒定染色體倍性的一個指標(biāo)（范光年，1990）。取二倍體植株和變異植株相同部位的葉片，平均分成上、中、下三部分，撕取葉片中部下表皮，按常規(guī)制片方法進行制片，于BM-2000顯微鏡下觀察，將Canon數(shù)碼相機安裝在顯微鏡上拍照，用Photo-shopCS3測量氣孔的大小和保衛(wèi)細(xì)胞的大小， 并用橢圓面積近似公式（S=長徑×短徑）求氣孔的面積（李雪嬌等，2010），各測量30個氣孔。

1.2.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測倍性 以二倍體墨蘭×大花蕙蘭F1代為對照，對多倍體植株的倍性進行測定。每個樣品重復(fù)2 次，按試劑盒（Partec CyStain UV Precise P）說明書流程操作。分別取待測二倍體植株和多倍體植株新鮮植物葉片0.5 cm2，置于培養(yǎng)皿中取400 μL的細(xì)胞核裂解液（CyStain UV Precise P， Partec GmbH）加于植物葉片之上用刀片將葉片切碎：橫向充分切碎后，縱向充分切碎裂解提取1 min將液體用30 μm濾網(wǎng)過濾至樣品管中加入1 600 μL染液（CyStain UV Precise P），避光60 s后，樣品進入流式細(xì)胞儀（Partec CyFlow Space）的藍色熒光通道進行分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)記錄整理，SPSS 2.0進行方差分析，使用LSD進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度和不同處理時間條件下秋水仙素誘導(dǎo)效果

表1結(jié)果顯示，不同的秋水仙素濃度和處理時間對墨蘭×大花蕙蘭F1代原球莖多倍體誘導(dǎo)的影響差異較大。與對照組（即秋水仙素為濃度0）相對比，在同一處理時間條件，秋水仙素濃度越高，原球莖死亡率越高，秋水仙素濃度為0.05%處理72 h和0.10%處理48 h的條件下，死亡率最高，達58%；原球莖變異率在處理24 h，隨著秋水仙素濃度的增加，變異率出現(xiàn)上升趨勢。綜合上述，0.03%秋水仙素處理72 h，墨蘭‘綠墨素和大花蕙蘭‘世界和平雜交蘭F1代原球莖變異率為36%，死亡率為36%，誘導(dǎo)效果最佳。

2.2 多倍體鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 從外觀形態(tài)來看，多倍體植株（A1）和原植株有明顯的差別。主要表現(xiàn)為多倍體植株根部木質(zhì)化，植株矮壯，葉色深綠，葉片變厚、變寬，葉面粗糙，少部分有雙葉脈（B1）、葉尖開裂（B2）和葉片扭曲（B3）等（圖1）。

由表2可知，多倍體植株的株高、葉長和葉形指數(shù)分別比原植株減少33.00%、27.92%、52.30%，而葉寬和葉面積分別比原植株增加55.78%、12.78%（P<0.01）。這說明墨蘭與大花蕙蘭雜交種多倍體體植株與二倍體植株在株高、葉長、葉寬和葉型指數(shù)上差異極顯著，葉片形態(tài)學(xué)外形指標(biāo)用來初步篩選變異植株是可行的。

2.2.2 氣孔、保衛(wèi)細(xì)胞鑒定 圖2結(jié)果顯示，多倍體植株（B1、B2）葉片的氣孔比二倍體植株（A1、A2）大，且單位面積內(nèi)的氣孔數(shù)減少。氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞的統(tǒng)計結(jié)果見表3。從表3可以看出，墨蘭與大花蕙蘭雜交種變異植株的氣孔長徑、氣孔短徑、氣孔面積、保衛(wèi)細(xì)胞長和保衛(wèi)細(xì)胞寬分別比二倍體植株增加24.11%、15.86%、43.59%、20.25%、34.37%（P<0.01）。表明所測數(shù)據(jù)均達差異極顯著水平，氣孔大小和保衛(wèi)細(xì)胞大小可以作為鑒定變異植株的參數(shù)。

2.2.3 倍性鑒定 細(xì)胞核DNA含量的比較，一般以G0-G1期細(xì)胞核DNA含量2C相對值的高低來表示。C峰二倍體墨蘭 × 大花蕙蘭植株（圖3：A2）、D峰是多倍體植株（圖3：B1）。其中二倍體墨蘭 × 大花蕙蘭植株的熒光通道值為88，多倍體植株熒光通道值是176。已知墨蘭 × 大花蕙蘭F1代植株為二倍體（2n=40）（圖3：A1），結(jié)合圖與熒光通道值即可看出墨蘭 × 大花蕙蘭多倍體植株為4x。因此，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，墨蘭 × 大花蕙蘭多倍體植株為四倍體。

3 討論

誘導(dǎo)材料在很大程度上決定著植物的誘變效果，所以選擇合適的誘導(dǎo)材料至關(guān)重要。由于秋水仙素只能作用于有絲分裂時期的細(xì)胞，故選取的誘導(dǎo)材料必須是幼嫩、分裂旺盛的組織或器官。目前用于多倍體誘導(dǎo)的植物體材料主要有原球莖、叢生芽、莖尖、愈傷組織、種子和幼葉等。在蘭科植物中，類原球莖（protocorm like-body， PLB）被認(rèn)為起源于單細(xì)胞，相當(dāng)于雙子葉植物體胚?！吨参锷飳W(xué)詞典》（1994年）中將之定義為植株基部由一團尚未分化的薄壁細(xì)胞組成的上端有頂端生長點和葉原基，下端有很多不定根、初具球莖形態(tài)的球狀體，是蘭科植物的一種再生方式。目前大量研究表明通過誘導(dǎo)PLBs可以獲得更高的植株誘導(dǎo)率和繁殖系數(shù)（李茂娟等，2012；曾楨迦等，2014；朱根發(fā)等，2004；Jatd et al， 2006；Le et al，2004）。此外，由于蘭科植物形態(tài)特征及繁殖方式的限制，對蘭花進行多倍體育種通常采用化學(xué)誘變結(jié)合組織培養(yǎng)方式，即在組織培養(yǎng)階段對原球莖或不定芽進行處理，來達到染色體加倍的目的（李智等， 2010）。本實驗以墨蘭‘綠墨素 × 大花蕙蘭‘世界和平雜交蘭的原球莖為誘導(dǎo)材料，成功誘導(dǎo)出四倍體植株，說明原球莖為墨蘭‘綠墨素 × 大花蕙蘭‘世界和平雜交蘭多倍體誘導(dǎo)的有效材料。

秋水仙素主要是對分裂期的細(xì)胞產(chǎn)生作用，會對紡錘絲的效果產(chǎn)生抑制，所以可以得到染色體加倍細(xì)胞（李涵等，2005）。在蘭花多倍體育種中，秋水仙素處理濃度通常在0.001%～5%之間，具體地視蘭花的種類及處理方法而定（李智等， 2010）。尹翠翠等（2010）在探討了雜交蘭四倍體之后發(fā)現(xiàn)，通過0.10%濃度的秋水仙素處理2 d后能夠獲得最佳變異效果，其變異率為36%。王玉英等（2014）對野生黃蟬蘭多倍體誘導(dǎo)研究表明以0.06%秋水仙素處理72 h的誘導(dǎo)效果最佳，最佳變異率高達62.5%。Kim et al（1997）用0.01%和0.05%秋水仙素處理寒蘭根狀莖，處理l周根狀莖的存活率分別為82.3%和57.2%，在再生植株中，0.01%處理2周、0.05%和 0.1%處理1周的多倍體（2n：66～80 ）誘導(dǎo)率分別為4.5%、5.2%和6.7%。雜交蘭莖尖的染色體加倍，生長速度就會降低，對培養(yǎng)基營養(yǎng)進行調(diào)節(jié)，并改變生長調(diào)節(jié)劑濃度，對植株激素進行調(diào)控，逐漸降低 NAA 的濃度至 0.10 mg·L-1，使其正常生長，獲得了株型粗壯，葉片粗糙寬厚的雜交蘭四倍體無菌苗（楊麗娟等，2008）。本試驗采用0.03%～0.1%的秋水仙素對雜交蘭原球莖的誘導(dǎo)均有效，0.03%處理72 h的條件下墨蘭與大花蕙蘭雜交種的變異率最高，獲得雜交種四倍體材料，研究結(jié)論與前人一致。

參考文獻：

DENG Y， ZHOU Y， CHEN JM， 2008. Methods of polyploid induction of Cymbidium with colchicine [J]. Subtrop Plant Sci，37（2）：38-40. [鄧櫻，周曄，陳繼敏， 2008. 秋水仙素誘導(dǎo)蘭屬“素心黃”多倍體的方法研究 [J]. 亞熱帶植物科學(xué)，37（2）：38-40.]

FAN GN， 1990. Is the guard cell of plants related to chromosome ploidy？ [J]. Plant J，（1）：22-23. [范光年，1990. 植物的保衛(wèi)細(xì)胞與染色體倍性有關(guān)嗎？ [J]. 植物雜志， （1）：22-23.]

FENG QX， WANG QP， 2007. Comprehensive evaluation for market value of Cymbidium hybridus [J]. J Shanghai Jiaotong Univ （Agric Sci Ed）， 25（6）：595-599. [馮秋霞， 王慶平， 2007. 大花蕙蘭商品價值的綜合評價 [J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版）， 25（6）：595-599.]

JATD S， CHAN MT， CHAI ML， et al， 2006. Priming abiotic factors for optimal hybrid Cymbidium（Orchidaceae）PLB and callus induction，plantlet formation，and their subsequent cytogenetic stability analysis [J]. Sci Hortic，109（4）：368-378.

KIM M， WON JY， SONG C， et al， 1997. Polyploi induction of Cymbid-ium kanran by treatment of cul chicine in vitro [J]. J Hortic Sci， 39 （1） ：73-76.

LIN F， DENG GC， 1997. Study on induction of mutation of Cymbidium goeringii [J]. J Hunan Agric Univ， 3（ 4） ： 39-43. [林芬， 鄧國礎(chǔ)，1997. 春蘭人工誘變的研究 [J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，3（ 4） ： 39-43.]

LI H， LONG CL， ZHENG SX， et al， 2005. Polyploid induction of Cymbidium iridioides and its biological characteristics [J]. Acta Hortic Sin， 32（ 5） ： 853-853. [李涵，龍春林，鄭思鄉(xiāng)，等，2005. 沉香虎頭蘭多倍體誘導(dǎo)及其鑒定 [J]. 園藝學(xué)報，32（ 5） ： 853-853.]

LI XJ， LI ZL， HUANG LP， 2010. Induction and identification of polyploids in wild Cymbidium lowianum [J]. Chin Agric Sci Bull，（13）：261-266. [李雪嬌， 李枝林， 黃麗萍，2010. 野生碧玉蘭多倍體誘導(dǎo)及鑒定 [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， （13）： 261-266.]

LI MJ， TAN BT， DENG SH， et al， 2012. Aseptic sowing and tissue culture of Cymbidium hybridum [J]. Hunan For Sci Technol，39（3）：26-29. [李茂娟，譚柏韜，鄧少華，等，2012. 大花蕙蘭無菌播種與組培快繁技術(shù)研究 [J]. 湖南林業(yè)科技，39（3）：26-29.]

LE VTH， TAKAMURA T， TANAKA M， 2004. Callus formation and plant regeneration from callus through somatic embryo structures in Cymbidium orchid [J]. Plant Sci，166（6）：1443-1449.

LI Z， YANG GS， YIN JM， 2010. Research advances on orchid polyploid breeding [J]. Chin J Trop Agric， （12）：34-38. [李智， 楊光穗， 尹俊梅， 2010. 蘭花多倍體育種研究進展 [J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， （12）：34-38.]

QIAN ZH， 2007. Research on rapid propagation technology of tissue culture of Cymbidium hybridus [J]. Mod Agric Sci Technol， 17：16. [錢張， 2007. 大花蕙蘭組培快繁技術(shù)研究 [J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 17：16.]

WANG YY， LI GH， LI ZM， et al， 2014. Preliminary study on polyploid induction in Cymbidium iridiodes D. Don [J]. Jiangsu Agric Sci， 42 （4） ：132-134. [王玉英， 李光宏， 李志敏， 等， 2014. 野生黃蟬蘭多倍體誘導(dǎo)初報 [J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 42 （4） ：132-134.]

YIN CC， ZHANG Y， ZHANG JH， et al， 2010. Tetraploid induction by colchicine and identification in Cymbidium interspecific hybrids [J]. J Nucl Agric Sci， 24（3）：518-521. [尹翠翠，張 燕， 張景華，等， 2010. 秋水仙素誘導(dǎo)雜交蘭四倍體及倍性鑒定 [J]. 核農(nóng)學(xué)報 ， 24（3）：518-521.]

YANG LJ， GAO SP， ZOU ZL， 2008. Primary studies on polyploid induction of Cymbidium hybrid in vitro [J] . Chin Seed Indus， （12）：60-61. [楊麗娟， 高素萍， 鄒宗蘭， 2008. 秋水仙素離體誘導(dǎo)大花蕙蘭多倍體試驗 [J] 中國種業(yè) ， （12） ：60-61.]

ZHANG YH， LI XY， WANG YY ， et al， 2016. Effect of different LED light qualities on the growth and the physiological indices of F1 of Cymbidium sinense × Cymbidium hybridum [J]. Chin J Trop Agric， 36（9）：1-6. [張宇歡， 李夏媛， 王玉英， 等， 2016. LED不同光質(zhì)對墨蘭×大花蕙蘭F1代組培苗生長及生理指標(biāo)的影響 [J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 36（9）：1-6.]

ZHAN ZG， XU C， 2011. Study on colchiploid of dendrobium of ficinale induced by colchicines [J]. J Zhejiang Univ（Sci Ed）， 38（3）：321-325. [ 詹忠根， 徐程， 2011. 秋水仙素誘導(dǎo)鐵皮石斛多倍體研究 [J] . 浙江大學(xué)學(xué)報（理學(xué)版），38（3） ：321-325].

ZHANG ZS， XIE L， XIAO AX， et al， 2005. Effects of colchicine treatment on growth， differentiation and mutagenseis of protocorm-like-body（PLB）of orchid [J]. Acta Agric Nucl Sin， 19（1） ： 19-23. [張志勝，謝 利，蕭愛興， 等， 2005. 秋水仙素處理蘭花原球莖對其生長和誘變效應(yīng)的影響 [J]. 核農(nóng)學(xué)報，19（1） ： 19-23.]

ZENG ZJ， LI F， JIA H， et al， 2014. Optimization of conditions for rapid propagation of Cymbidium hybridum protocorm [J]. J Yibin Univ，（12）：118-120. [ 曾楨迦， 李芳， 賈黃，等， 2014. 大花蕙蘭原球莖快速繁殖條件的優(yōu)化 [J]. 宜賓學(xué)院學(xué)報， （12）：118-120.]

ZHU GF， CHEN ML， LUO ZW， et al， 2004. Induction and propagation of hybrid protocorm like-body of crosses between Cymbidium sinense and Cymbidium hybridum [J]. Acta Hortic Sin， 31（5）：688-690. [朱根發(fā)， 陳明莉， 羅智偉， 等， 2004. 墨蘭與大花蕙蘭種間雜種原球莖的誘導(dǎo)及增殖研究 [J]. 園藝學(xué)報，31（5）：688-690.]

ZHANG XM， ZHOU HJ， ZHANG QX， et al， 2004. The study on flora polyploid breeding [J]. Heibei J For Orch Res， 19（3）：288-293. [張曉曼，周懷軍，張啟翔， 等， 2004. 花卉多倍體育種研究 [J] 河北林果研究 ， 19（3）：288-293.]