復(fù)方鹿角霜的急性毒性研究

羅尚文 王燕燕 張學(xué)農(nóng) 韓師師

摘 要 目的：研究復(fù)方鹿角霜的急性毒性。方法：將40只SPF級(jí)昆明小鼠分為空白對(duì)照組（等體積羧甲基纖維素鈉）和復(fù)方鹿角霜低、中、高劑量組（浸膏混懸液6、14、34 g/kg，分別相當(dāng)于成人臨床推薦日劑量的192、448、1 088倍），每組10只，雌雄兼半，均灌胃給藥1次。給藥前和給藥后14 d內(nèi)，觀察小鼠存活情況及其急性毒性反應(yīng)；給藥前、給藥時(shí)和給藥后2、3、7、14 d測(cè)定小鼠體質(zhì)量；給藥后14 d解剖小鼠，檢查小鼠體表、給藥局部和天然孔道，顱腔和腦的外表面，胸腔、腹腔和盆腔以及腔內(nèi)臟器，記錄病變情況。結(jié)果：各組小鼠均全部存活?？瞻讓?duì)照組和復(fù)方鹿角霜低劑量組小鼠未見異常；復(fù)方鹿角霜中劑量組雄性小鼠未見明顯異常，4只雌性小鼠于給藥后20～23 min開始出現(xiàn)眼睛閉合癥狀，給藥后27 min開始逐漸恢復(fù)，給藥后29 min全部恢復(fù)正常；復(fù)方鹿角霜高劑量組小鼠于給藥后8～29 min開始出現(xiàn)眼睛閉合、活動(dòng)減少、弓背、豎毛等癥狀，給藥后1 h開始逐漸恢復(fù)，給藥后6 h全部恢復(fù)正常。與空白對(duì)照組比較，復(fù)方鹿角霜低、中、高劑量組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組小鼠體表、給藥局部和天然孔道，顱腔和腦的外表面，胸腔、腹腔和盆腔以及腔內(nèi)臟器[包括腎上腺（雙側(cè)）、腦（大腦、小腦和腦干）、食道、心、腎（雙側(cè)）、大腸（盲腸、結(jié)腸和直腸）、小腸、肝、肺、胰腺、脾、胸腺、胃、膀胱等]均未見明顯病變。結(jié)論：在復(fù)方鹿角霜灌胃給藥34 g/kg劑量下，小鼠產(chǎn)生急性毒性反應(yīng)；14 g/kg劑量下，部分雌性小鼠產(chǎn)生輕度急性毒性反應(yīng)；6 g/kg劑量下，未見明顯急性毒性反應(yīng)。

關(guān)鍵詞 復(fù)方鹿角霜；小鼠；急性毒性

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）14-1904-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.08

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the acute toxicity of Compound lujiao cream. METHODS： A total of 40 SPF Kunming mice were divided into blank control group （constant volume of sodium carboxymethylcellulose）， Compound lujiao cream low-dose， medium-dose and high-dose groups （extract suspension， 6， 14， 34 g/kg， as 192， 448， 1 088 folds of recommended human clinical daily dose， respectively）， with 10 mice in each group， male and female in half. They were given medicine intragastrically once.Before medication and within 14 d after medication，the survival， toxic reaction were observed.Body weights of mice were measured before medication， during medication and 2，3，7，14 d after medication. The mice was scarified 14 d after medication. The pathological changes of body surface， administration site and natural channels， the external surface of the cranial cavity and brain， thoracic cavity， abdominal cavity， pelvic cavity and visceral organs were also observed. RESULTS： All mice survived. No abnormality was found in blank control group and Compound lujiao cream low-dose group. In Compound lujiao cream medium-dose group， no significant abnormality was found in male mice； 4 female mice suffered eye closure 20-23 min after medication， and then began to recover 27 min after medication and returned to normal 29 min after medication. In Compound lujiao cream high-dose group， mice suffered from eye closure， activity reduction， arched back and hair shaft 8-29 min after medication， but recovered 1 h after medication. Compared with blank control group， there was no significant difference in body weight of mice in Compound lujiao cream low-dose， medium-dose and high-dose groups （P>0.05）. There was no significant lesion in body surface， administration site and natural channels， the external surface of the cranial cavity and brain， thoracic cavity， abdominal cavity， pelvic cavity and visceral organs [adrenaline （bilateral）， brain （brain， cerebellum， brain stem）， esophagus， heart， kidney （bilateral）， large intestine （cecum， colon and rectum）， small intestine， liver， lung， pancreas， spleen， thymus， stomach， bladder]. CONCLUSIONS： After using Compound lujiao cream of the intragastric dose of 34 g/kg， the mice suffer from acute toxicity reaction； by the dose of 14 g/kg， some female mice suffer from mild acute toxic reaction； by the dose of 6 g/kg， no obvious acute toxicity reaction was found.

KEYWORDS Compound lujiao cream； Mouse； Acute toxicity

復(fù)方鹿角霜由鹿角霜、鹿銜草、忍冬藤、露蜂房、桑枝、桂枝等6味中藥組合而成，經(jīng)中醫(yī)長(zhǎng)期臨床使用證明其具有抗炎消腫、疏利關(guān)節(jié)、強(qiáng)筋健骨等功效。目前該方已被宜昌市中心人民醫(yī)院引進(jìn)，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病。由于該方原有劑型為煎劑，而其煎煮過程煩瑣復(fù)雜，攜帶及服用均不便。本課題組前期運(yùn)用現(xiàn)代中藥制劑理論[1-2]，將該煎劑轉(zhuǎn)化為片劑，并已完成該制劑的提取工藝研究，制定了相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[3]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)小鼠單次灌胃給予復(fù)方鹿角霜，觀察其出現(xiàn)的急性毒性反應(yīng)，旨在為其安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

FA2204C型電子分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；U-3000型高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex公司）；4 ℃/-20 ℃低溫冰箱（青島海爾股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

復(fù)方鹿角霜浸膏（宜昌市中心人民醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)：130613，每1 g浸膏相當(dāng)于8 g生藥，馬錢苷含量：4.63 mg/g）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110523）；實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠40只，雌雄兼半，27～28日齡，體質(zhì)量18.5～21.9 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2008-0008，動(dòng)物合格證號(hào)：42000600001319。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2012-0065。動(dòng)物飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)[獨(dú)立通氣籠具（IVC）]中，每籠5只；配有壓差及溫濕度監(jiān)控和自動(dòng)控制系統(tǒng)。動(dòng)物飼料中營(yíng)養(yǎng)成分及環(huán)境污染物由供應(yīng)商定期常規(guī)檢測(cè)，不含有可能干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果及動(dòng)物健康的已知污染物；動(dòng)物飲用水均經(jīng)高溫高壓消毒。除給藥和解剖檢查前禁食外，其余時(shí)間動(dòng)物自由采食。

2 方法

2.1 復(fù)方鹿角霜混懸液的制備

準(zhǔn)確稱取CMC-Na 0.15 g，加適量水使充分溶脹并混勻成糊狀，逐漸加入水?dāng)嚢杈鶆虿⒍ㄈ葜?00 mL，制成0.5%CMC-Na溶液作溶劑，2～8 ℃保存，8 d內(nèi)使用。準(zhǔn)確稱取復(fù)方鹿角霜浸膏樣品適量，加上述溶劑制成質(zhì)量濃度分別為0.15、0.35、0.85 g/mL的混懸液，給藥當(dāng)天制備，制備后6 h內(nèi)完成給藥。

2.2 復(fù)方鹿角霜混懸液分析

復(fù)方鹿角霜混懸液含量測(cè)定以馬錢苷[3-5]為指標(biāo)，其均一性、質(zhì)量濃度結(jié)果也均以馬錢苷為指標(biāo)進(jìn)行考察。

2.2.1 均一性 復(fù)方鹿角霜混懸液從上、中、下3層分別取樣，平行取樣2次，每份10 mL（一份用于分析，另一份用作備份），取樣之前輕輕攪拌該混懸液30 min，取樣過程中也進(jìn)行適當(dāng)攪拌。均一性標(biāo)準(zhǔn)：上、中、下3層的馬錢苷質(zhì)量濃度在理論濃度的85%～115%之間，且RSD小于10%。

2.2.2 質(zhì)量濃度 以“2.2.1”項(xiàng)下上、中、下3層測(cè)定結(jié)果的均值作為復(fù)方鹿角霜混懸液的質(zhì)量濃度。質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)：馬錢苷質(zhì)量濃度在理論濃度的85%～115%之間。

2.3 分組與給藥

將40只SPF級(jí)昆明小鼠分為空白對(duì)照組（等體積CMC-Na）和復(fù)方鹿角霜低、中、高劑量組（6、14、34 g/kg，分別相當(dāng)于成人臨床推薦日劑量的192、448、1 088倍[6]），每組10只，雌雄兼半。各組小鼠均灌胃給藥1次。

2.4 急性毒性反應(yīng)觀察

給藥前和給藥后14 d內(nèi)，觀察各組小鼠存活情況及其急性毒性反應(yīng)發(fā)生情況（如眼睛閉合、活動(dòng)減少、弓背、豎毛等癥狀）。

2.5 體質(zhì)量測(cè)定

給藥前、給藥時(shí)和給藥后2、3、7、14 d測(cè)定各組小鼠體質(zhì)量。

2.6 解剖檢查

觀察期結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行解剖檢查，解剖檢查前小鼠禁食過夜。存活小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉，放血后立即解剖檢查。如有非計(jì)劃死亡的小鼠需盡快解剖檢查；死亡尸體若不能及時(shí)解剖檢查，需放置冰箱中冷藏保存以減少臟器自溶。解剖時(shí)檢查內(nèi)容包括：可見動(dòng)物體表、給藥局部和天然孔道；顱腔和腦的外表面；胸腔、腹腔和盆腔以及腔內(nèi)臟器，包括腎上腺（雙側(cè)）、腦（大腦、小腦和腦干）、食道、心、腎（雙側(cè)）、大腸（盲腸、結(jié)腸和直腸）、小腸、肝、肺、胰腺、脾、胸腺、胃、膀胱等，并記錄所有檢查過程中發(fā)現(xiàn)的肉眼病變。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用LSD檢驗(yàn)；多組間數(shù)據(jù)比較采用方差齊性Levene檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方鹿角霜混懸液分析結(jié)果

復(fù)方鹿角霜混懸液上、中、下3層的馬錢苷質(zhì)量濃度在理論濃度的92.9%～100.7%之間，且上、中、下3層復(fù)方鹿角霜混懸液質(zhì)量濃度的RSD小于3.18%，符合標(biāo)準(zhǔn)。復(fù)方鹿角霜混懸液分析結(jié)果見表1。

3.2 急性毒性反應(yīng)觀察結(jié)果

各組小鼠均全部存活。空白對(duì)照組和復(fù)方鹿角霜低劑量組小鼠未見異常；復(fù)方鹿角霜中劑量組雄性小鼠未見明顯異常，4只雌性小鼠于給藥后20～23 min開始出現(xiàn)眼睛閉合癥狀，給藥后27 min開始逐漸恢復(fù)，給藥后29 min全部恢復(fù)正常；復(fù)方鹿角霜高劑量組小鼠于給藥后8～29 min開始出現(xiàn)眼睛閉合、活動(dòng)減少、弓背、豎毛等癥狀，給藥后1 h開始逐漸恢復(fù)，給藥后6 h全部恢復(fù)正常。

3.3 體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，復(fù)方鹿角霜低、中、高劑量組小鼠各時(shí)段體質(zhì)量差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表2。

3.4 解剖檢查結(jié)果

各組小鼠體表、給藥局部和天然孔道，顱腔和腦的外表面，胸腔、腹腔和盆腔以及腔內(nèi)臟器[包含腎上腺（雙側(cè)）、腦（大腦、小腦和腦干）、食道、心、腎（雙側(cè)）、大腸（盲腸、結(jié)腸和直腸）、小腸、肝、肺、胰腺、脾、胸腺、胃、膀胱等]均未見明顯病變。

4 討論

在本實(shí)驗(yàn)中未見動(dòng)物瀕死和非計(jì)劃死亡。解剖檢查各組小鼠組織/臟器的體積、顏色、質(zhì)地等均未見明顯異常。因未見有病變的組織/臟器，本實(shí)驗(yàn)未采集組織作組織病理學(xué)檢查。但相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果指出，復(fù)方鹿角霜的毒性可能與神經(jīng)肌肉反射相關(guān)[7-8]，故應(yīng)在后續(xù)的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)關(guān)注此方面，以發(fā)現(xiàn)其可能的毒性靶器官。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單次給予34 g/kg劑量的復(fù)方鹿角霜，小鼠出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為眼睛閉合、活動(dòng)減少、弓背、豎毛等癥狀，給藥后6 h全部恢復(fù)正常；單次給予14 g/kg劑量的復(fù)方鹿角霜，部分雌性小鼠出現(xiàn)輕微急性毒性反應(yīng)，主要表現(xiàn)為眼睛閉合癥狀，給藥后29 min全部恢復(fù)正常；單次給予6 g/kg劑量的復(fù)方鹿角霜，小鼠未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)。這表明，復(fù)方鹿角霜對(duì)小鼠單次灌胃給藥，最大耐受量高于34 g/kg，最大無毒性反應(yīng)劑量不低于6 g/kg。

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（收稿日期：2017-11-21 修回日期：2018-01-19）

（編輯：張 靜）