周瓊 胡姍姍 郝慶林

摘要：? 為了實(shí)現(xiàn)羅漢果生產(chǎn)中免除人工授粉和果實(shí)無籽化，該研究利用pBI121-Gus構(gòu)建果實(shí)特異啟動子2A11與生長素合成相關(guān)基因iaaM的嵌合基因（2A11-iaaM）過量表達(dá)載體，以羅漢果雌株葉盤為材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立羅漢果高效遺傳轉(zhuǎn)化體系，轉(zhuǎn)化和創(chuàng)制單性結(jié)實(shí)羅漢果種質(zhì)，通過基因特異引物對的PCR擴(kuò)增，初步檢測出轉(zhuǎn)基因陽性植株，將之移栽大田，觀察轉(zhuǎn)基因植株的單性結(jié)實(shí)性的表現(xiàn)。結(jié)果表明：構(gòu)建羅漢果單性結(jié)實(shí)性相關(guān)的pBAI-Gus植物雙元表達(dá)載體獲得成功;建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的羅漢果葉盤遺傳轉(zhuǎn)化優(yōu)化體系，即農(nóng)桿菌菌液OD600值為0.3～0.5，侵染10 min，最優(yōu)選擇培養(yǎng)基為MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+Kan 5 mg·L-1+Cef 300 mg·L-1;經(jīng)PCR鑒定共獲得4株轉(zhuǎn)基因陽性雌株;將陽性植株擴(kuò)繁后移栽田間，經(jīng)田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，24株陽性擴(kuò)繁植株中有5株正常開花，占總植株數(shù)的20.8%，且其子房未經(jīng)人工授粉發(fā)育成幼果，表現(xiàn)單性結(jié)實(shí)性。在載體構(gòu)建和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將外源單性結(jié)實(shí)相關(guān)嵌合基因整合進(jìn)羅漢果基因組并得到表達(dá)，為后續(xù)研究單性結(jié)實(shí)羅漢果的遺傳生理，創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因羅漢果單性結(jié)實(shí)新種質(zhì)，以及克服其產(chǎn)業(yè)化中需要人工授粉和無籽化提供了理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 羅漢果， 單性結(jié)實(shí)， 轉(zhuǎn)基因， 遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號：? Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2018）12-1614-12

Transformation of Siraitia grosvenorii with 2A11-iaaM gene

Zhou Qiong1， Hu Shanshan1， Hao Qinglin1， Mo Yanmei1， Li Gang2*， Tang Meiqiong2， Xin Jiajia1， Ning Yizhen1

（ 1. College of Agriculture， Guangxi University， Nanning 530004， China; 2. Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant， Nanning 530023， China ）

Abstract：? To solve the seedless fruit and artificial pollination problems of Siraitia grosvenorii， we used pBI121-Gus to construct chimeric expression vector （pBI121-2A11-iaaM-Gus） with fruit specific promoter 2A11 and auxin synthesis key enzyme tryptophan monooxygenase enzyme gene iaaM. We took leaf disc of female plants as explants to study the antibiotics sensitivity， the impact of bacteriostatic in different concentrations of agrobacterium EHA105， and the different microbial infection time， to establish an efficient agrobacterium-mediated genetic transformation system of S. grosvenorii， and to create the parthenocarpy germplasm of S. grosvenorii. We also designed gene specific primers， and detected the positive plants by PCR technique and transplanted into the field， while recorded the hereditary characters of the transgenic plants. The results showed that the chimeric expression vector （pBI121-2A11-iaaM-Gus） related to parthenocarpy character of S. grosvenorii was successfully constructed， and the agrobacterium-mediated genetic transformation system of S. grosvenorii leaf disc was established. The optimal concentration of infection of agrobacterium tumefaciens was the OD600 value 0.3-0.5， while the optimal infection time was 10 min. And the optimal selective medium was with 5 mg·L-1 kanamycin and 300 mg·L-1 cefotaxime sodium. PCR results showed that four female plants of S. grosvenorii were tested positive. We propagated the four positive female plants in the plant tissue culture room and transplanting the propagated 24 positive female plants to the field. Then the field investigation showed that there were five female plants flowering normally with a proportion of 20.8%， and the S. grosvenorii young fruits which had not been artificially pollinated were observed， which suggested the parthenocarpy character was expressed. The study， integrating the exogenetic parthenocarpy gene into the S. grosvenorii genome and? preliminarily expressed， based on expression vector construction and the agrobacterium-mediated genetic transformation system of S. grosvenorii， provides the information for the subsequent study of the genetic physiology， the creation of the transgenosis parthenocarpy germplasm of S. grosvenorii， and solving the seedless fruit and artificial pollination problems of S. grosvenorii.

Key words： Siraitia grosvenorii， parthenocarpy， transgenosis， genetic transformation

中藥材羅漢果（Siraitia grosvenorii）是葫蘆科多年生宿根性草質(zhì)藤本植物羅漢果 （Siraitia grosvenorii） 的干燥果實(shí)，具有提神生津、清熱潤肺、止咳定喘、滑腸通便等效用，是我國特有的藥用和甜料經(jīng)濟(jì)作物，第一、第二批均被國家衛(wèi)生部、中醫(yī)藥管理局列為藥食同源品種（國家藥典委員會，2015;李鋒等，2010;張維等，2014）。現(xiàn)代藥理、毒理研究表明，羅漢果具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟、降低血脂等多種作用，卻無毒副作用。羅漢果果實(shí)主要有效成份為葫蘆烷四環(huán)三萜皂苷，以甜苷Ⅴ含量最高，約占總皂苷含量的20%，是世界上最強(qiáng)的非糖甜味物質(zhì)之一，萬分之一濃度時(shí)為5%蔗糖甜度的425倍，高甜、低熱、天然、保健，具有廣闊的開發(fā)前景和市場空間（Li et al，2014;秦瑩瑩和李嘯紅，2012）。但是，羅漢果具有雌雄異株的發(fā)育生物學(xué)特點(diǎn)，且花粉粘重而不利于風(fēng)媒傳粉，野生大黑蜂減少而影響栽培品種的蟲媒傳粉。在栽培生產(chǎn)中，需要大量人工授粉，才能獲得經(jīng)濟(jì)效益，而自然條件下羅漢果花粉壽命短，通常需要在開花當(dāng)天上午完成授粉，勞動成本高。因此，羅漢果栽培生產(chǎn)中迫切需要解決“如何免除人工授粉”的難題。此外，羅漢果的種子中不含甜苷而含有大量種油，不僅影響口感，又增加了提取純化的難度以及加工成本。雖然已有三倍體無籽羅漢果研究的報(bào)道，但因果實(shí)小、生長期短等原因，迄今尚無可應(yīng)用于生產(chǎn)的三倍體優(yōu)良品種。因此，如何免除人工授粉和實(shí)現(xiàn)果實(shí)無籽化，是羅漢果產(chǎn)業(yè)化發(fā)展中亟待解決的技術(shù)難題。

單性結(jié)實(shí)是指子房不經(jīng)受精而形成無籽果實(shí)的現(xiàn)象，與生長素信號、或赤霉素信號途徑等有關(guān)（劉迪等，2008）。單性結(jié)實(shí)植株具有結(jié)實(shí)率高、品質(zhì)優(yōu)良、果實(shí)無籽、無畸形果、可穩(wěn)定遺傳等優(yōu)勢，是食用、加工和生產(chǎn)中追求的重要目標(biāo)（Pandolfini et al，2002;毛自朝等，2002）。除了自然存在的可遺傳的單性結(jié)實(shí)以外，還可以通過激素誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等獲得單性結(jié)實(shí)。在雌花開花的當(dāng)天利用2，4-D涂抹羅漢果子房壁，也可刺激子房膨大，每隔8～10 d涂1次，共2～3次，還可得到與人工授粉大小相等的單性結(jié)實(shí)果實(shí)（李珍貞和鄔輝平，1988）。但激素處理技術(shù)要求較高，濃度難以控制，容易產(chǎn)生畸形果，需要較多勞動力，還存在激素殘留影響健康，故生產(chǎn)上不宜推廣采用。培育單性結(jié)實(shí)羅漢果新種質(zhì)不僅能克服其生產(chǎn)中迫切需要解決的人工授粉的主要難題，也能解決授粉帶來的果實(shí)有籽難題，是羅漢果產(chǎn)業(yè)化發(fā)展和育種的最佳選擇和熱點(diǎn)前沿。

運(yùn)用基因工程的方法，轉(zhuǎn)入與內(nèi)源激素代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因來創(chuàng)制單性結(jié)實(shí)，從而獲得無籽果實(shí)，已經(jīng)成為植物遺傳工程的主要手段，在番茄、茄子、草莓、樹莓和甜瓜等物種中獲得轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)植株，但還沒有關(guān)于羅漢果轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)的報(bào)道（陶煉，2013）。2A11啟動子是來源于番茄的果實(shí)特異性表達(dá)啟動子，具有良好的驅(qū)動外源基因組織特異性表達(dá)的啟動子活性（Van Haaren & Catherine，1991;林炳英等，2006）。iaaM基因主要來源于根癌農(nóng)桿菌和假單孢菌，編碼色氨酸單加氧酶，可利用色氨酸合成吲哚乙酸，從而提高生長素含量，將iaaM與子房或幼果特異啟動子組成的嵌合基因?qū)胫参矬w中，使用其在開花期和果實(shí)發(fā)育早期表達(dá)，可誘導(dǎo)茄子、番茄等以果實(shí)為主要收獲對象的植物的單性結(jié)實(shí)（荊風(fēng)雪，2013;Rotino et al，1997;Ficcadenti et al，1999）。本研究擬在植物雙元表達(dá)載體pBI121-Gus基礎(chǔ)上，構(gòu)建2A11-iaaM的過量表達(dá)載體，利用葉盤轉(zhuǎn)化法，研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)的羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化體系，創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)羅漢果雌性種質(zhì)，為深入其遺傳生理研究、品種培育等提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與處理所用的材料取自種植于廣西藥用植物園實(shí)驗(yàn)基地的已開花的羅漢果雌株，選取幼嫩帶有腋芽的羅漢果莖段，用75%酒精消毒30 s，0.1% HgCl2消毒10 min，無菌蒸餾水沖洗5次，之后用無菌濾紙吸干莖段表面水分，并將莖段接種于MS培養(yǎng)基中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱進(jìn)行組織培養(yǎng)，設(shè)置溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光照時(shí)間為12 h·d-1。由此獲得的羅漢果無菌苗用于后續(xù)遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化所用pBI121-Gus植物雙元表達(dá)載體、含pMD-2A11克隆子的大腸桿菌、含pMD-iaaM克隆子的大腸桿菌、根癌農(nóng)桿菌EHA105均由廣西藥用植物園李剛副研究員提供。其中，2A11和iaaM分別是從櫻桃番茄總DNA中克隆的果實(shí)特異啟動子和從根癌農(nóng)桿菌C58菌株DNA中克隆的生長素合素相關(guān)酶基因，啟動子2A11上、下游特異性引物分別引入限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ和Xba I酶切位點(diǎn)，經(jīng)目標(biāo)基因、載體等核酸序列分析，于iaaM基因上、下游特異性引物的5′端分別引入限制性核酸內(nèi)切酶Xba I和Xma I酶切位點(diǎn)（表1）。前述各菌液（加少量甘油）保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 試劑和儀器試劑：胰蛋白胨、酵母提取物、蔗糖、瓊脂、MS培養(yǎng)基（不含蔗糖）、6-BA、IBA、TDZ、NAA、乙酰丁香酮、頭孢霉素、利福平、卡那霉素、氯仿、異戊醇、CTAB、PVP、β-巰基乙醇、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒等均購自上海生工;pMDTM19-T simple vector、限制性核酸內(nèi)切酶Xba I、Xma I、HindⅢ和TaqTM購自Takara和Thermo;2×Es Taq MasterMix（含染料）購自北京康為世紀(jì);引物合成及核酸測序由華大基因公司完成。儀器：移液槍（Eppendorf）、高速冷凍離心機(jī)（湘儀，TGL-16M）、PCR儀（BIO RAD，T100 Thermal Cycler）、電泳儀（DYY-10C）、（經(jīng)濟(jì)型）雙人單面垂直凈化工作臺（SW-CJ-2D）、振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚，ZQZY-HC）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)，HH-B11·420S）、高壓滅菌鍋（ZEALWAY，G180T）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠）、紫外分光光度計(jì)等。

1.1.3 培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+Kan 5 mg·L-1+Cef 300 mg·L-1。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1。愈傷組織分化培養(yǎng)基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1+蕓苔素內(nèi)酯 0.5 mg·L-1。不定芽增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1。生根培養(yǎng)基：MS+NAA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1。

1.1.4 所用引物本研究中用到的所有引物如表1所示。

1.2 嵌合表達(dá)載體pBI121-2A11-iaaM的構(gòu)建

1.2.1 載體和目的片段質(zhì)粒提取將保存于-80 ℃冰箱的pBI121-Gus菌液接種到含50 μg·mL-1 Kan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫，200 r·min-1過夜振蕩培養(yǎng)。用無菌接種環(huán)在超凈工作臺挑取上述菌液，并于含50 μg·mL-1 Kan的LB固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)得出單菌落。用無菌槍頭挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。pMD-2A11和pMD-iaaM菌液的擴(kuò)大培養(yǎng)方法同上，其中LB培養(yǎng)基中加入的抗生素和抗生素濃度為50 μg·mL-1 Amp。按照SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒（Sangon）說明書對上述擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，并取3 μL質(zhì)粒DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，觀察質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量及完整性，用超微量紫外分光光度計(jì)測定DNA的濃度及純度。

1.2.2 pBI121-Gus與2A11的連接由于iaaM基因序列內(nèi)含HindⅢ限制性酶切位點(diǎn)，所以載體構(gòu)建中，先連接啟動子2A11，再連接目的基因iaaM。pMD-2A11質(zhì)粒和pBI121-Gus質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)使用Xba I和HindⅢ限制性內(nèi)切酶，反應(yīng)條件為37 ℃ 2 h，酶切反應(yīng)體系見表2。將上述酶切反應(yīng)產(chǎn)物分別進(jìn)行切膠回收目的片段和載體片段，并檢測回收片段的質(zhì)量和濃度。配制連接反應(yīng)體系：10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 μL，目的基因 4.5 μL，載體1.5 μL，T4 DNA Ligase（350 U·μL-1） 1.5 μL，加水至總體積20 μL，16 ℃水浴連接過夜。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，常規(guī)涂板于含有IPTG、X-gal和Kan（50 μg·mL-1）的LB固體平板培養(yǎng)基上（按《分子克隆》中相應(yīng)說明操作），培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化平板的白色單菌落于加有Kan 50 μg·mL-1的LB液體培養(yǎng)基上中，37 ℃恒溫，200 r·min-1搖床培養(yǎng)過夜;通過菌液PCR鑒定陽性克隆，將陽性克隆的菌斑提取質(zhì)粒，酶切檢測再次確定陽性克隆菌斑，得到具有目的基因的中間表達(dá)載體pBI121-2A11。

1.2.3iaaM和中間載體pBI121-2A11的連接pMD-iaaM質(zhì)粒和pBI121-2A11質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)使用Xba I和Xma I限制性內(nèi)切酶，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)體系見表3，連接方法同1.2.2。得到嵌合表達(dá)載體pBI121-2A11-iaaM。設(shè)計(jì)引物對（跨啟動子和目的基因全長）AI1F和AI1R，用于后續(xù)PCR檢測。采用AI1F和AI1R引物對一次性擴(kuò)增出包含2A11和iaaM基因的序列，做T克隆，送去華大基因測序公司測序，測序所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對、分析，證實(shí)無誤后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化-

1.3.1 抗生素Kan敏感性試驗(yàn)分別配制含有不同濃度 （0、2、4、6、8、10、13、16、20、30 mg·L-1）Kan的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將預(yù)培養(yǎng)4 d的羅漢果葉盤進(jìn)行接種，每個(gè)試驗(yàn)接種8瓶，每瓶接種10個(gè)葉盤。置于恒溫光照培養(yǎng)箱，設(shè)置培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1，培養(yǎng)25 d后記錄葉盤生長情況。-

1.3.2 抗生素Cef抑菌試驗(yàn)分別配制含有不同濃度 （0、50、100、200、300、400、500 mg·L-1） Cef的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，將經(jīng)過相同預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)操作的羅漢果葉盤用無菌水清洗以后進(jìn)行接種，

每個(gè)試驗(yàn)接種8瓶，每瓶接種10個(gè)葉盤。置于恒溫光照培養(yǎng)箱，設(shè)置培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1，培養(yǎng)兩周后記錄葉盤生長情況。-

1.3.3 農(nóng)桿菌侵染菌液濃度的確立取3 mL振蕩培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌菌液，于紫外分光光度計(jì)下測定OD600值，并稀釋為不同OD600（0.1、0.3、0.5、0.7）的菌液，分別對預(yù)培養(yǎng)4 d的羅漢果葉盤進(jìn)行相同時(shí)間的侵染，將侵染后的葉盤接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含100 μmol AS），每個(gè)試驗(yàn)接種3瓶，每瓶接種20個(gè)葉盤。置于黑暗條件下共培養(yǎng)3 d后，進(jìn)行選擇培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1，培養(yǎng)兩周后記錄葉盤生長情況。-

1.3.4 農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的確立用相同濃度的農(nóng)桿菌菌液對預(yù)培養(yǎng)4 d的羅漢果葉盤進(jìn)行侵染，侵染時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min，將侵染后的葉盤接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含100 μmol AS），每個(gè)試驗(yàn)接種3瓶，每瓶接種20個(gè)葉盤。置于黑暗條件下共培養(yǎng)3 d后，進(jìn)行選擇培養(yǎng)，設(shè)置培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)間12 h·d-1，培養(yǎng)兩周后記錄葉盤生長情況。

1.4 pBI121-2A11-iaaM基因?qū)α_漢果的轉(zhuǎn)化-

1.4.1 羅漢果雌株葉盤的準(zhǔn)備與預(yù)培養(yǎng)將羅漢果雌株無菌葉片用滅過菌的打孔器打出直徑約0.5 cm的小圓片，劃傷葉背面及葉脈，接種在葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，并使傷口充分接觸培養(yǎng)基表面。黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)4 d，直至葉盤周邊表現(xiàn)卷曲、上翹、膨大并產(chǎn)生顆粒狀愈傷。-

1.4.2 載體菌液準(zhǔn)備從-80 ℃冰箱取出已轉(zhuǎn)入pBI121-2A11-iaaM基因的農(nóng)桿菌菌液，在附加50 μg·mL-1 Kan、20 μg·mL-1 rif的YEB固體平板上進(jìn)行劃線，28 ℃培養(yǎng)48 h;挑取單菌落，接種到10 mL附加50 μg·mL-1 Kan、20 μg·mL-1 rif的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h;取上述菌液1 mL加入50 mL新配制的無抗生素的YEB液體培養(yǎng)基，同時(shí)加入100 μmol的AS，28 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)6 h左右，使得菌液OD600為0.3～0.5時(shí)即可用于侵染。-

1.4.3 侵染于超凈工作臺上，將預(yù)培養(yǎng)4 d的羅漢果葉盤接種到上述準(zhǔn)備的載體菌液中，28 ℃，150 r·min-1浸泡10 min;迅速取出葉盤并用無菌濾紙吸去附著的菌液;將侵染過的羅漢果葉盤接種在葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含100 μmol AS）上，黑暗條件下共培養(yǎng)3 d。-

1.4.4 選擇培養(yǎng)用無菌水清洗經(jīng)過共培養(yǎng)的羅漢果葉盤，無菌濾紙吸干后接種到葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含5 mg·L-1 Kan、300 mg·L-1 Cef）上，光照條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng);將經(jīng)過選擇培養(yǎng)2周后的羅漢果葉盤用無菌水清洗后，接種到葉片愈傷組織分化培養(yǎng)基（含5 mg·L-1 Kan、100 mg·L-1 Cef）上，光照條件下進(jìn)行繼代選擇培養(yǎng)，直至開始分化產(chǎn)生不定芽。-

1.4.5 不定芽增殖培養(yǎng)將經(jīng)過繼代選擇培養(yǎng)后產(chǎn)生不定芽的愈傷組織轉(zhuǎn)接至含5 mg·L-1 Kan、100 mg·L-1 Cef的不定芽增殖培養(yǎng)基，光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。-

1.4.6 生根培養(yǎng)待不定芽生長的長度在2 cm以上時(shí)，切下并插入含5 mg·L-1 Kan、100 mg·L-1 Cef的生根培養(yǎng)基中，在光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，2周左右長出不定根。

1.5 分子檢測

采用CTAB法微量提取已生出不定根的植株的部分莖葉，利用設(shè)計(jì)出的特異引物（表1）擴(kuò)增目的片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：0.5 μL DNA，5 μL 2×Es Taq MasterMix，0.4 μL引物F/R，加水至總體

系10 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃ 8～10 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，并在凝膠成像系統(tǒng)中成像。

本研究設(shè)計(jì)了三套特異引物共同用于PCR擴(kuò)增檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株（表1），目的在于提高PCR檢測陽性植株的準(zhǔn)確性，使檢測結(jié)果更具可靠性。其中，2A11 F/R是針對果實(shí)特異啟動子2A11序列設(shè)計(jì)的特異引物，iaaM F/R是針對單性結(jié)實(shí)基因iaaM序列設(shè)計(jì)的特異引物，AI CF/R是同時(shí)跨部分目的基因和部分啟動子序列設(shè)計(jì)的特異引物。

1.6 田間調(diào)查

將經(jīng)過PCR檢測呈陽性的擬轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)繁，生根之后先于網(wǎng)室大棚環(huán)境中煉苗5～7 d;再轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)缽中生長20 d左右，使得組培苗充分適應(yīng)外界環(huán)境條件;最后移栽大棚，觀察記錄性狀表現(xiàn)。

2結(jié)果與分析

2.1 pBI121-Gus與2A11的連接

選擇Hind Ⅲ 和Xba I分別對pBI121-Gus和pMD-2A11進(jìn)行酶切，分別切去pBI121-Gus的CaMV35S啟動子回收大片段線性化植物雙元表達(dá)載體，切去pMD 19-T載體回收小片段2A11，將2A11連接進(jìn)pBI121-Gus載體后的圖譜見圖1。其中，2A11質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果得出1 300 bp左右的目的片段和2 700 bp左右的pMD 19-T simple vector片段（圖2）。將2A11與線性化pBI121-Gus連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，涂板，在藍(lán)白篩選平板上挑取8個(gè)菌斑，經(jīng)過PCR檢測（圖3），這8個(gè)菌斑全為陽性，選擇1，2，3號菌斑做雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果均為陽性。

2.2 iaaM和中間載體pBI121-2A11的連接

iaaM基因與中間載體pBI121-2A11連接轉(zhuǎn)化后挑取8個(gè)菌斑，經(jīng)過PCR檢測和雙酶切驗(yàn)證得出2個(gè)陽性菌斑。測序所得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，結(jié)果顯示啟動子片段2A11基因序列和目標(biāo)基因片段iaaM基因序列與已報(bào)道的2A11和iaaM基因序列，同源性都為99%，可編碼相應(yīng)蛋白序列。構(gòu)建好的嵌合載體pBI121-2A11-iaaM圖譜如圖4所示。

2.3 抗生素Kan敏感性試驗(yàn)

羅漢果葉盤對抗生素Kan的敏感性試驗(yàn)結(jié)果如表4。從表4可見，羅漢果葉盤的持綠率和出芽率隨著Kan濃度增加而降低，芽的分化和生長也隨之緩慢直至停止萎蔫。羅漢果葉盤的持綠率自Kan濃度高于4 mg·L-1起開始下降，而出芽率在Kan濃度低于6 mg·L-1時(shí)均維持在較高水平，過高的Kan濃度會影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長分化，濃度過低又難以起到篩選作用。由此可判斷，羅漢果葉盤分化出芽過程對抗生素Kan的選擇壓為5 mg·L-1。

2.4 抗生素Cef抑菌試驗(yàn)

由表5可知，羅漢果葉盤的污染率和出芽率隨

著Cef濃度的增加而降低，且Cef的濃度為300～500 mg·L-1時(shí)，污染率為0，抑菌效果最佳，同時(shí)在此濃度范圍內(nèi)，Cef濃度為300 mg·L-1時(shí)，羅漢果葉盤的出芽率相對較高。過低的Cef濃度難以抑菌，過高的Cef濃度又會抑制出芽。由此可判斷，抗生素Cef抑制羅漢果葉盤感染農(nóng)桿菌的最佳濃度為300 mg·L-1。

2.5 農(nóng)桿菌侵染菌液濃度的確立

由表6可知，羅漢果葉盤的污染率隨著農(nóng)桿菌菌液濃度的增加而升高，同時(shí)羅漢果葉盤的出芽率隨著農(nóng)桿菌菌液濃度的增加而降低。過高的農(nóng)桿菌菌液濃度（OD600=0.7），會導(dǎo)致羅漢果葉盤污染嚴(yán)重，不能分化出芽;過低的農(nóng)桿菌菌液濃度（OD600=0.1），則會影響轉(zhuǎn)化的效率。由此可判斷，農(nóng)桿菌用于侵染時(shí)的菌液OD600值最好為0.3～0.5。

2.6 農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的確立

由表7可知，羅漢果葉盤的污染率隨農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的增加而升高，同時(shí)羅漢果葉盤的出芽率隨農(nóng)桿菌侵染時(shí)間的增加而降低。當(dāng)農(nóng)桿菌侵染時(shí)間超過15 min，會導(dǎo)致羅漢果葉盤污染嚴(yán)重，不能分化出芽;而農(nóng)桿菌侵染時(shí)間過短，又會影響遺傳轉(zhuǎn)化的效率。由此可判斷，農(nóng)桿菌用于侵染時(shí)的最佳時(shí)間為10 min。

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2.7 羅漢果葉盤的再生組織培養(yǎng)

圖5顯示了羅漢果葉盤經(jīng)侵染之后的共培養(yǎng)情況、愈傷組織誘導(dǎo)情況、分化出芽情況以及生根培養(yǎng)情況。調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在已優(yōu)化羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)上，對羅漢果葉盤進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及后續(xù)組織培養(yǎng)。由此可看出，羅漢果葉盤侵染之后顏色鮮綠，長勢良好，分化出芽情況正常。

2.8 轉(zhuǎn)化植株的分子檢測

經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和抗性培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，共得到15個(gè)抗性芽，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d后，采用CTAB法微量提取植株部分莖葉DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，結(jié)果如圖6所示。根據(jù)特異引物（表1）進(jìn)行PCR檢測擴(kuò)增目的片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，綜合三套特異引物的檢測結(jié)果，結(jié)果顯示共有4株轉(zhuǎn)化植株擴(kuò)增出目的條帶（圖7）。

2.9 田間調(diào)查

將PCR檢測呈陽性的擬轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)繁生根后移栽大棚，觀察記錄性狀表現(xiàn)。結(jié)果顯示，擴(kuò)繁之后的24株擬轉(zhuǎn)基因陽性植株在營養(yǎng)生長時(shí)期長勢良好，葉色鮮綠，葉型正常。在開花期有5株擬轉(zhuǎn)基因植株正常開花，占總植株數(shù)的20.8%，且開花植株的子房在掛果期未經(jīng)授粉即發(fā)育成果實(shí)，表現(xiàn)單性結(jié)實(shí)性。對轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)的羅漢果果實(shí)和正常人工授粉得到的羅漢果果實(shí)，在果實(shí)發(fā)育75 d后分別隨機(jī)取樣10個(gè)，統(tǒng)計(jì)果實(shí)的橫徑、縱徑、重量以及種子情況（表8），果實(shí)的縱剖手工切片照片見圖8。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)果實(shí)比正常人工授粉果實(shí)具有果形小、種子數(shù)極少且不具種仁等特點(diǎn)。有關(guān)轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)果實(shí)發(fā)育品質(zhì)的形成、遺傳生理規(guī)律以及大量轉(zhuǎn)化苗的鑒定、篩選工作仍在進(jìn)一步的研究之中。

3討論

本研究將嵌合有果實(shí)特異啟動子2A11與生長素合成相關(guān)基因iaaM連入pBI121-Gus，成功構(gòu)建了pBI121-2A11-iaaM-Gus過量表達(dá)載體，并建立和優(yōu)化了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的以羅漢果葉片為受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系。首先，以預(yù)培養(yǎng)4 d的羅漢果葉盤接種到OD600值為0.3～0.5，含100 μmol的AS的農(nóng)桿菌菌液中，侵染10 min，迅速取出葉盤并用無菌濾紙吸去附著的菌液; 將侵染過的羅漢果葉

盤接種在葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含100 μmol AS）上，黑暗條件下共培養(yǎng)3 d;選擇培養(yǎng)基：MS+TDZ 0.7 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+Kan 5 mg·L-1+Cef 300 mg·L-1。然后，經(jīng)過不定芽增殖、壯苗培養(yǎng)后，進(jìn)行分子鑒定。

本研究前期受體預(yù)實(shí)驗(yàn)表明，羅漢果種子苗胚軸可經(jīng)過體細(xì)胞胚性愈傷發(fā)生途徑成苗，但因性別鑒定困難，所以采用羅漢果雌株葉片為受體。葉盤轉(zhuǎn)化法是Horsch et al（1985）建立的一種簡便有效的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法，最高轉(zhuǎn)化頻率達(dá)15%，是目前雙子葉植物較為常用的轉(zhuǎn)化技術(shù)，但得到的轉(zhuǎn)化體有可能是嵌合體（王蕾，2007）。羅漢果葉片經(jīng)胚性愈傷發(fā)生途徑成苗困難，所以，遺傳轉(zhuǎn)化后采用器官發(fā)生途徑直接成苗，轉(zhuǎn)化后的植株多細(xì)胞起源，存在嵌合現(xiàn)象，為此，實(shí)驗(yàn)中采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行兩次鑒定，即在對增殖芽第一次鑒定后，取芽尖擴(kuò)繁，再進(jìn)行第二次鑒定。PCR擴(kuò)增技術(shù)作為一種快捷、靈敏的基因檢測方法，能夠簡便有效地確定已整合進(jìn)外源基因的植株，但PCR的檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性。為獲得更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究在對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測時(shí)，同時(shí)使用了2A11、iaaM以及跨2A11和iaaM部分序列的嵌合基因的三套特異引物進(jìn)行檢測。

本研究根據(jù)經(jīng)驗(yàn)， 自然條件下若無人工輔助授

粉，栽培羅漢果極少因蟲媒或風(fēng)媒等原因結(jié)出果實(shí)，通常被認(rèn)為與栽培羅漢果蜜腺退化、大黑蜂減少、花粉粘重等因素有關(guān);但嚴(yán)謹(jǐn)起見，為防止羅漢果開花期間蟲媒或風(fēng)媒傳粉的干擾，實(shí)驗(yàn)安排將經(jīng)過分子鑒定為陽性的擬轉(zhuǎn)基因植株種植于孔徑1 mm見方的網(wǎng)室大棚中，且僅種有羅漢果雌株（附近沒有羅漢果雄株），既從源頭上杜絕了羅漢果雄花花粉來源，也在一定程度上防止了昆蟲傳授異源花粉引起的干擾。

經(jīng)分子鑒定所得轉(zhuǎn)基因羅漢果陽性植株，部分正常開花，并不經(jīng)授粉而長成小果，由于T0代轉(zhuǎn)基因羅漢果受病毒影響較重，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)、其內(nèi)源激素含量、單性結(jié)實(shí)性等可能受到影響。利用單性結(jié)實(shí)品種，由于不需要種植雄株以提供花粉，可以增加單位面積上雌株的植株數(shù)而提高產(chǎn)量。單性結(jié)實(shí)品種能克服低溫、弱光、授粉困難等，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和種植范圍， 果實(shí)使用加工

方便，市場前景好（Hazra & Dutta，2010;Yan，2010;Shabtai，2007）。研究表明，轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)番茄果實(shí)的品質(zhì)沒有異常變化（Rotino，2005），利用CPPU誘導(dǎo)的甜瓜單性結(jié)實(shí)果實(shí)中蔗糖和果糖比有籽果中含量高（Li，2011）。單性結(jié)實(shí)基本代謝譜沒有改變，是其結(jié)構(gòu)、風(fēng)味和營養(yǎng)沒有顯著變化的主要原因（Picone，2011）。轉(zhuǎn)基因單性結(jié)實(shí)羅漢果的單性結(jié)實(shí)性、品質(zhì)、產(chǎn)量、適應(yīng)性、次生代謝等表現(xiàn)如何尚有待進(jìn)一步研究。

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