薛帥，鐘自彪，蘭佳男，胡前超，向濤，熊艷，王彥峰，葉啟發(fā)， （.武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢大學(xué)肝膽疾病研究院，武漢大學(xué)移植醫(yī)學(xué)中心，移植醫(yī)學(xué)技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 43007；.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，衛(wèi)生部移植醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 4003）

腎移植是治療腎臟終末期疾病的最佳選擇［1］。但是供體的缺乏促使了標(biāo)準(zhǔn)化心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD）器官的廣泛使用［2］，然而DCD器官存在較長(zhǎng)的熱缺血時(shí)間，其近遠(yuǎn)期療效均較差。傳統(tǒng)的靜態(tài)冷保存 （static cold storage，SCS）與低溫機(jī)械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）理論上更接近正常生理情況，理論上器官保護(hù)上具有潛在應(yīng)用前景，并且對(duì)擴(kuò)大供體池的研究也具有潛在意義，研究表明HMP能夠有效改善DCD供腎的質(zhì)量，但是具體機(jī)制仍不明確［3-4］?；诖?，本中心自主創(chuàng)建家兔自體腎移植模型［5］，用以探索HMP對(duì)DCD器官保護(hù)的機(jī)制。

血?dú)夥治鍪菣z測(cè)患者生命體征的一項(xiàng)重要指標(biāo)，已經(jīng)廣泛用于臨床各科患者［6］。由于腎移植患者體質(zhì)差，常合并貧血，水電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂及多器官不同程度的損害，腎移植過(guò)程中容易引起術(shù)中血流動(dòng)力學(xué)、血生化及血?dú)獾葍?nèi)環(huán)境的變化［7］，圍術(shù)期血?dú)夥治龅慕Y(jié)果是判定預(yù)后的重要指標(biāo)。為此，本研究利用家兔自體腎移植模型，探究圍術(shù)期血?dú)鈱?duì)腎移植術(shù)后家兔生存率的影響。

1 材料與方法

1.1 家兔自體腎移植模型的建立：從萬(wàn)千佳和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物文化中心獲得20只健康雄性兔〔12周齡，體重（3.0±0.3） kg〕 。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照《中華人民共和國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條例》進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)前一天將家兔禁食過(guò)夜，但不禁水。將家兔固定于兔盒上，用1%戊巴比妥鈉（3 ml/kg）麻醉后，沿著腹中線進(jìn)行解剖以暴露兔的左腎蒂。將兔子的左腎蒂夾持35分鐘來(lái)模擬熱缺血時(shí)間（warm ischemia time，WIT），然后松開(kāi)血管夾恢復(fù)腎臟血液灌注1小時(shí)，然后用留置針進(jìn)行腎動(dòng)脈穿刺。通過(guò)留置針注射50 ml的4℃乳酸鹽林格液沖洗腎臟。然后將留置針連接LifePort灌注儀（LifePort Kidney Transporter machines，Organ Recovery Systems，Chicago，IL，USA）行低溫機(jī)械灌注。灌注壓固定為60 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa），溫度維持在4℃以下。機(jī)械灌注4小時(shí)后，縫合腎動(dòng)脈穿刺點(diǎn)。摘除右腎，然后用37℃的溫水對(duì)腹腔進(jìn)行復(fù)溫，關(guān)閉腹腔。石蠟棉球擦拭導(dǎo)尿管，插入兔子尿道。另一端接引流袋收集尿量。術(shù)后動(dòng)物食物中添加抗菌藥物預(yù)防感染，室內(nèi)溫度保持在25℃［8］。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)：灌注期間每30分鐘從家兔耳緣靜脈抽取0.2 ml的血液快速用血?dú)馄洼p便式血?dú)夥治鰞x分析家兔靜脈血?dú)獠磿r(shí)記錄。術(shù)后24小時(shí)檢測(cè)家兔生命體征。分析術(shù)后家兔血?dú)庾兓?4小時(shí)后存活的家兔采血進(jìn)行肌酐和尿素氮的檢測(cè)以及尿量的統(tǒng)計(jì)。根據(jù)血?dú)夥治龇譃锳組和B兩組，A組為術(shù)中血?dú)庵稻S持在正常范圍內(nèi)；B組為術(shù)中血?dú)庵党氏陆第厔?shì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。分類變量用百分率（%）表示。連續(xù)變量的差異用成組t檢驗(yàn)比較。尿量、肌酐和尿素氮應(yīng)用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血?dú)夥治觯ū?，圖1）：A組家兔6只，灌注過(guò)程中家兔血?dú)庵祷颈３植蛔?，pH值始終維持在正常范圍內(nèi)，而B(niǎo)組家兔8只，在灌注過(guò)程中pH值呈下降趨勢(shì)，由7.390±0.033下降至7.117±0.031（表1）。從60分鐘后開(kāi)始，兩組之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），從150分鐘開(kāi)始，兩組之間具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。再灌注結(jié)束時(shí)A組家兔的堿剩余值（BE值）為（-1.00±1.58）；B組的值為（-9.42±1.89），也具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。而相比于A組的值（20.34±1.11）mmol/L，B組的值 僅 為（14.68±1.44）mmol/L。其中BE值 和提示了術(shù)后家兔體內(nèi)酸堿代償情況。

表1 家兔腎臟低溫機(jī)械灌注4小時(shí)后兩組的pH值變化情況（±s）

表1 家兔腎臟低溫機(jī)械灌注4小時(shí)后兩組的pH值變化情況（±s）

注：與B組相比，aP＜0.05，bP＜0.001

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min 180min 210 min 240 min A 組 6 7.411±0.037 7.395±0.054 7.400±0.051a 7.404±0.031a 7.398±0.027b 7.408±0.027b 7.405±0.030b 7.423±0.047b 7.404±0.023b B 組 8 7.386±0.033 7.334±0.038 7.294±0.036 7.260±0.036 7.232±0.038 7.202±0.036 7.164±0.038 7.138±0.031 7.117±0.031

圖1 家兔在體機(jī)械灌注過(guò)程中血?dú)庾兓闆r

2.2 生存率（圖2）：術(shù)后24小時(shí)統(tǒng)計(jì)家兔經(jīng)歷在體HMP之后復(fù)灌24小時(shí)的生存率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A組中存活5只，B組也存活5只。同時(shí)，A組和B組的生存率分別是83.3%和62.5%（P＜0.05）。A組與B組相比，A組24小時(shí)移植存活率明顯升高。

圖2 家兔術(shù)后再灌注24小時(shí)內(nèi)生存率變化

2.3 腎功能指標(biāo)（圖3）：術(shù)后24小時(shí)后檢測(cè)存活家兔腎功能指標(biāo)，結(jié)果顯示A組尿量為（116.80±6.55）ml/d，B組尿量為（75.20±6.94）ml/d，差異具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。A組的肌酐為（342.00±18.81）μmol/L；B 組為（518.00±23.54）μmol/L，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。A組的尿素氮為（9.20±2.01）mmol/L；而B(niǎo)組為（23.40±3.33）mol/L，兩組之間的差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

圖3 家兔在體機(jī)械灌注過(guò)程后中腎功能變化情況

3 討 論

在家兔在體機(jī)械灌注的過(guò)程中，B組家兔的代謝性酸中毒的原因可能是：① 未禁食的家兔容易在術(shù)中發(fā)生腸系膜淤血，腸道腫脹術(shù)后難以恢復(fù)，并且易發(fā)生腸道粘連性梗阻，導(dǎo)致家兔水電解質(zhì)紊亂和酸中毒；② 實(shí)驗(yàn)用于麻醉的戊巴比妥鈉對(duì)呼吸和循環(huán)具有明顯抑制性作用，可能加重酸中毒。酸中毒可以升高血鉀，進(jìn)而對(duì)循環(huán)過(guò)程有不利影響，最終影響生存率。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)家兔在機(jī)械灌注過(guò)程中的血?dú)庵档姆€(wěn)定與否與家兔自體腎移植后腎功能以及生存率存在著一定關(guān)系。造成24小時(shí)后家兔尿量下降、肌酐和尿素氮的上升。同時(shí)酸的分泌以及碳酸氫鹽和堿等同物的回收和再生過(guò)程的障礙，造成腎移植后家兔腎臟功能不能及時(shí)代償已有的酸中毒，最終引起心臟功能紊亂，造成家兔死亡。在臨床上，而血?dú)鈱?duì)患者預(yù)后和生存率具有十分重要的影響，這正好契合了需要接受腎移植治療的患者，因?yàn)樗嶂卸驹谀I移植受者中普遍存在［9］。腎移植術(shù)后發(fā)生嚴(yán)重酸中毒患者較未發(fā)生嚴(yán)重酸中毒患者的腎功能恢復(fù)更慢［10］。代謝性酸中毒是腎移植術(shù)后常見(jiàn)的并發(fā)癥，這是由于移植腎不能再生碳酸氫鹽緩沖液引起的，而各種類型的酸中毒都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝紊亂，影響移植物和患者的生存［11］。

免疫抑制藥物的應(yīng)用也是臨床上移植后酸中毒的原因之一，其在腎單位質(zhì)量減少的過(guò)程中起著重要作用，最終造成腎小管過(guò)程的普遍損害，而腎小管分泌和重吸收過(guò)程有助于酸的分泌以及碳酸氫鹽和堿等價(jià)物的回收和再生。這被描述為導(dǎo)致腎小管功能障礙，即腎小管酸中毒（renal tubular acidosis，RTA）［12］。另一方面胰島素誘導(dǎo)近端腎小管氨合成，但免疫抑制藥物（例如皮質(zhì)類固醇和鈣調(diào)磷酸酶抑制劑）可能賦予腎移植患者胰島素抗性，造成氨合成障礙，最終導(dǎo)致酸中毒影響患者預(yù)后［13］。

臨床腎移植患者圍手術(shù)期內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多變，通過(guò)圍術(shù)期血?dú)獗O(jiān)測(cè)的可以及時(shí)有效地維護(hù)水、糖、電解質(zhì)平衡及給與營(yíng)養(yǎng)支持治療［14］。圍術(shù)期及時(shí)檢測(cè)、糾正酸中毒在改善腎移植預(yù)后的過(guò)程中十分必要，酸堿平衡對(duì)于臨床危重患者具有重要意義［15］。同樣，在家兔在體低溫機(jī)械灌注模型中，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要及時(shí)檢測(cè)家兔內(nèi)環(huán)境，及時(shí)糾正內(nèi)環(huán)境紊亂，比如術(shù)中應(yīng)不停地使用溫鹽水浸泡的紗布覆蓋暴露在外的腸道組織及黏膜，及時(shí)糾正酸中毒、補(bǔ)鈣降鉀、輔助呼吸等相應(yīng)措施，才能成功建立穩(wěn)定的模型。這可能比手術(shù)本身更加需要學(xué)者的關(guān)注。