李揚

【摘要】目的：通過使用三氧化二砷（As2O3）誘導雌激素受體（estrogen receptor，ER）的再次表達，通過對乳腺癌細胞生長曲線的研究來探討ER在陰性乳腺發(fā)展過程中的作用。方法：本研究以ER陰性的人乳腺癌細胞MDA-MB-231為研究對象，采用免疫組化、生長曲線檢測法等生物學方法來檢測ER在陰性乳腺癌發(fā)展過程中的作用。結果：以MCF-7作為陽性對照，免疫組化結果顯示，As2O3可以誘導ER的再次產生。進一步觀測MDA-MB-231細胞的生長曲線，發(fā)現(xiàn)ER可明顯抑制其生長，與對照組相比，有顯著性差異（P<0.05）。結論：ER的再表達可抑制陰性乳腺癌細胞MDA-MB-231的生長。

【關鍵詞】乳腺癌；雌激素受體（ER）；腫瘤生長

乳腺癌（breast cancer）是女性人群中常見的惡性腫瘤，嚴重危害著女性健康。在中國，乳腺癌已經占到了各種惡性腫瘤的10%左右，而且隨著生活環(huán)境的改變，發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢[1]。越來越多的研究證實，雌激素在女性乳腺癌發(fā)展過程中有關鍵性作用，顯示乳腺癌的發(fā)展具有雌激素依賴性。雌激素主要通過雌激素受體（ER）發(fā)揮作用，與乳腺癌的生長密切相關，ER的表達量過低可促進乳腺癌細胞的增殖、轉移，甚至抑制乳腺癌細胞的凋亡[2]。其可作為評估乳腺癌治療的激素依賴性和預測內分泌治療效果的分子標志物。

目前臨床上，對于ER陽性的乳腺癌患者多采用抗雌激素、雌激素撤除等辦法來進行內分泌治療。但有研究報道，目前還有1/3的乳腺癌患者屬于ER陰性，這些患者對內分泌治療不敏感，而且預后差。因此如何使ER陰性的乳腺癌細胞再次表達ER以及其表達后對乳腺癌發(fā)展的影響研究便對臨床有著重要的意義。

本研究以ER陰性的人乳腺癌細胞MDA-MB-231為研究對象，使用國內最早報道用于誘導治療的化學物質AS203誘導ER的再次表達，通過對乳腺癌細胞生長曲線的研究來探討ER在其發(fā)生、發(fā)展過程中的意義，以期為ER陰性乳腺癌患者的治療提供一條新的思路。材料與方法

1.1 材料

細胞株：ER陰性人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購買于上海細胞庫；ER陽性人乳腺癌細胞株MCF-7購買于山東大學保藏中心。

主要試劑：三氧化二砷（AS203）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

雌激素受體（ER）陽性人乳腺癌細胞株MCF-7，常規(guī)培養(yǎng)；雌激素受體（ER）陰性人乳腺癌細胞株MDA-MB-231常規(guī)培養(yǎng)，將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞調整細胞濃度為 5×105/mL，換含AS203的培養(yǎng)液，至AS2O3終濃度分別為5.0μmol/L，連續(xù)培養(yǎng)48小時。

1.2.2 實驗步驟

免疫組化：（1）細胞爬片。取對數(shù)生長期的細胞進行常規(guī)消化制成單細胞懸液，加入到預先已經放置蓋玻片的24孔板中，每孔加入預先計算的細胞懸液量，放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，取出蓋玻片，PBS洗干凈，風干。冷丙酮固定10min.（2）加入3%HZOZ適量，37℃，30min，以用來清除內源性過氧化物酶的影響；洗干凈；山羊血清封閉；加入ER抗體，過夜；洗干凈，加辣根酶標記的鏈霉卵白素，37℃，30min，洗干凈；DAB顯色，顯微鏡下觀察；自來熟洗滌，蘇木素染色，沖洗反藍；酒精脫水，二甲苯透明，封片。用PBS代替一抗制成陰性對照。MCF-7作為陽性對照。

Westem Blot實驗：（1）提取細胞的總蛋白。收集經過不同處理的盡量多的細胞，預冷的1×PBS洗3次，800g，離心5min/每次。棄上清，加入細胞裂解液適量，置于冰上裂解10min，每隔2min吹打一次，800g，離心5min。（2）吸取上清利用己準備好的標準曲線計算出濃度并進行WB實驗。

生長曲線實驗：將對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞調整細胞濃度為5×105/mL，換含As2O3的培養(yǎng)液，至As2O3終濃度分別為5.0μmol/L，連續(xù)培養(yǎng)48h。采用電子監(jiān)控技術監(jiān)測其生長變化。

1.3 判定結果染色為陽性的細胞為

細胞或者細胞漿會出現(xiàn)黃棕色顆粒。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPASS統(tǒng)計軟件。

2 結果

2.1 乳腺癌細胞陰性檢測

與陽性對照MCF-7相比，MDA-MB-231乳腺癌細胞AS2O3處理前免疫組化結果顯示為陰性，染色部位主要為胞漿少量表達，顏色較淺；在As2O3處理后，主要表達在細胞核和胞漿，顏色較深，說明ER重造成功，結果如圖1所示。

2.2 MDA-MB-231乳腺癌細胞ER的蛋白表達情況

Westem Blot結果如圖2所示，ER呈陰性的MDA-MB-231細胞株，ER不表達，而經As2O3處理后，MDA-MB-231細胞株ER表達，但與陽性細胞株MCF-7相比較，其表達量較低。

2.3 ER對MDA-MB-231乳腺癌細胞株生長曲線的影響。

實驗分為兩組（contrl組，即未經As2O3處理；實驗組，經As2O3處理），采用電子檢測探究ER對MDA-MB-231乳腺癌細胞株生長曲線的影響。結果如圖3所示，處理后細胞生長曲線變得平緩，細胞生長受到抑制，提示我們或許ER抑制了MDA-MB-231細胞的生長。

3 討論

ER蛋白是否表達是乳腺癌臨床激素治療的一個腫瘤標記物。在臨床中，對于ER陽性乳腺癌會采用抗雌激素的手段來進行治療。但還有約1/3的乳腺癌患者在初次診斷時，ER表達呈現(xiàn)陰性而無法得到治療，因此是否可以將這些患者由ER陰性轉化為陽性進而使用內分泌療法進行治療。

Baj等[3]，報道砷劑對乳腺癌細胞株有誘尋凋亡的作用。Karasulu等[4]報道低濃度As2O3對正常機體細胞影響很小，但可以引起乳腺癌細胞系MCF-7的凋亡。Chow等[5]實驗研究結果表明，As2O3可明顯抑制乳腺癌細胞系MCF-7的生長。同時具有下調腫瘤細胞Bcl-2的表達以及上調p53基因表達的作用。魏玲等[b]通過實驗得出As2O3在體外可顯著抑制乳腺癌胞株MDA-MB-231細胞生長并引起凋亡，其機制可能與阻滯細胞周期有關。As2O3誘導ER再次表達已經有相關報道。

本研究中采用As2O3對ER陰性的人乳腺癌細胞進行處理，使之重新表達ER。從免疫組化和WB結果可以看出，As2O3確實可以誘導ER的再次表達，但對于其具體機制還需要進一步研究。已經有研究報道，這可能與ER基因CpG島異常甲基化有關[7-9]。總結目前的研究其機制可能有：（1）ER基因的啟動子區(qū)域高度的甲基化，使得相關的基因轉錄因子不能結合到該區(qū)域；（2）高度甲基化的啟動子區(qū)域與組蛋白乙酞化狀態(tài)有關，染色體結構改變，導致其不易被轉錄[10，11]。生長曲線結果提示我們ER可抑制乳腺癌細胞的生長，這或許可以為臨床治療ER陰性患者提供一定的思路。

目前我們正在進行更進一步的研究，來進一步探究As2O3誘導ER再次表達的機制以及其對內分泌治療的反應性。已經有研究發(fā)現(xiàn)As2O3可誘導MDA-MB-231乳腺癌表達ERα，并且這種表達是有效表達，能夠使MDA-MB-231細胞系ERα基因中CpG島發(fā)生去甲基化。之后使用他莫昔芬（TAM）進行治療時，細胞增殖受到明顯限制[12]。這也提示我們陰性乳腺癌患者不表達ER可能是因為基因島的異常甲基化有關，可能與基因突變、缺失等無關，這或許為ER陰性乳腺癌患者的治療提供了一條新的思路。我們將進一步將實驗擴展到體內，采用動物試驗和臨床試驗進一步研究，以期為臨床治療ER陰性的乳腺癌患者提供福音，為醫(yī)護人員提供一定的理論支撐。

參考文獻

[1]Zheng G，Peng F，Ding R，etal.Identification ofproteins responsible for themultiple drug resistance in5-fluorouracilinduced breastcancer cell using proteomicsanalysis[J].Cancer Res ClinOncol，2010，136：1477-1488.

[2]王海霞，解其貴，趙俊紅等.子宮內膜癌雌激素受體α、β和孕激素受體mRNA與臨床病理的關系[J].中國臨床醫(yī)學，2008，15（06）：863-865.