劉曉柱，李銀鳳，趙 燕，張學文*

(1.貴州理工學院 食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550003； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學 生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410000)

植物花器官發(fā)育是植物生長周期的重要過程，對于大多數(shù)農(nóng)作物而言不僅是決定其產(chǎn)量和經(jīng)濟價值形成的重要階段，也是植物學界研究的重要領(lǐng)域[1]。對于植物而言，器官形態(tài)的最終形成取決于建立起形態(tài)模式后對細胞分裂方向和分裂頻次的控制和分化，而生長素(Auxin)在這一過程中起決定性作用[2]。

近年來，關(guān)于擬南芥雌蕊發(fā)育及模式建成的研究十分活躍，已從遺傳分析和激素調(diào)控兩方面獲得了深入的認識[3]。Nemhauser等[4]發(fā)現(xiàn)并提出了雌蕊中頂端至基部生長素濃度梯度模型，在該模型中雌蕊頂端存在高濃度的生長素，促進了柱頭和花柱的伸長和分化，子房中存在中間濃度的生長素，雌蕊底端的花托中存在低水平的生長素。提高頂端生長素濃度可彌補一些花柱促因子的缺失。心皮是構(gòu)成雌蕊的基本單位，說明心皮發(fā)育過程中存在生長素濃度梯度的分布。Sundberg等[5]利用DR5∶∶GFP系統(tǒng)對擬南芥花器官發(fā)育過程生長素的分布研究指出，在雌蕊發(fā)育過程中，柱頭產(chǎn)生高濃度的生長素，并維持一種頂端至基部的極性分布，子房中存在中間濃度的生長素，胚珠中產(chǎn)生低水平的生長素，保證胚珠的發(fā)育成熟。受精完成后，胚胎中生長素迅速增加。

生長素通過運輸載體進行極性運輸實現(xiàn)其在植物體內(nèi)的差異分布，而這種差異分布是調(diào)控植物生命過程的必要先決條件[6]。PIN家族是目前一種公認的生長素輸出載體，極性分布在細胞膜上，負責生長素的內(nèi)外運輸，調(diào)控生長素濃度梯度動態(tài)平衡[7-8]。擬南芥、水稻、蘋果、麻瘋樹、狗薔薇等的PIN基因已被克隆, 并進行了深入研究，證實了其參與植物器官的生長發(fā)育、向性運動、胚胎發(fā)育等過程[9-11]。

薺菜為十字花科1年生草本植物，在生理特性和遺傳背景上與擬南芥非常接近，但心皮形態(tài)卻差異巨大：薺菜為心形心皮結(jié)構(gòu)，而擬南芥為柱形心皮結(jié)構(gòu)。造成薺菜心皮形態(tài)的獨特性機制還不清楚，推測可能與生長素的極性分布有關(guān)，因此構(gòu)建生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP，探析生長素在薺菜心皮發(fā)育中的極性分布，利用RT-PCR克隆薺菜PIN3(CbPIN3)基因編碼區(qū)，并進行生物信息學分析以及表達分析，旨在為揭示薺菜心皮形態(tài)建成奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及植物材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) GV3101、質(zhì)粒pEGAD、pBI121均由湖南農(nóng)業(yè)大學細胞生物學實驗室保存。

野生型薺菜采自湖南農(nóng)業(yè)大學耘園教學實習基地。

1.2 試劑及試劑盒

蛋白胨、甘油、瓊脂、常用抗生素購自上海生工生物有限公司；磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鎂、無水乙醇、冰醋酸等均為分析純，購自廣州化學試劑有限公司；TaqDNA聚合酶、T4 DNA 連接酶、各種限制性內(nèi)切酶、DNA分子質(zhì)量標準均購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

各種抗生素貯存液均按《分子克隆實驗指南》[12]配制。

1.3 培養(yǎng)基

本研究所用LB、YEB、1/2 MS培養(yǎng)基的配制均參考《分子克隆實驗指南》[12]。

1.4 試驗方法

1.4.1 生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP的構(gòu)建 參照Ulmasov等[13]方法，設(shè)計了生長素特異響應(yīng)啟動子DR5，該啟動子序列由3部分組成：生長素響應(yīng)元件DR5、35S minimal promoter、TMV leader(Ω′)。DR5啟動子全序列設(shè)計如下：

AAGCTTCTATACTAAGTTCATGATAATAGTTGCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCCTTTTGTCTCCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGATATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACATCTAGA。

DR5啟動子由上海英駿生物公司合成。

采用HindⅢ、XbaⅠ雙酶切DR5以及載體pBI121，回收酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶16 ℃過夜反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含有50 μg/L卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基上，挑選白色克隆。堿法小批量抽提法抽提質(zhì)粒，酶切檢測后送測序，構(gòu)建正確的載體命名為pBI121-DR5。

采用高保真酶擴增GFP基因，BamHⅠ、SacⅠ雙酶切GFP擴增產(chǎn)物以及載體pBI121-DR5，回收純化酶切產(chǎn)物，T4 DNA連接酶16 ℃過夜反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含有50 μg/L Kan的LB培養(yǎng)基上，挑選白色克隆。堿法小批量抽提法抽提質(zhì)粒，酶切檢測后送測序，構(gòu)建正確的載體命名為pBI121-DR5∶∶GFP。本研究所用引物見表1，由北京華大基因生物有限公司合成。

1.4.2 生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP轉(zhuǎn)化野生型薺菜 利用凍融法將載體pBI121-DR5∶∶GFP轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101中，通過菌落PCR檢測后，接種至新鮮YEB培養(yǎng)基中(利福平 20 mg/L+慶大霉素30 mg/L+Kan 50 mg/L)，培養(yǎng)24 h。當野生型薺菜植株生長至主花序10 cm左右，次花序在蓮座開始形成時，剪掉已開花或?qū)⒁_花的花苞，進行薺菜的遺傳轉(zhuǎn)化，收取成熟轉(zhuǎn)基因薺菜種子進行篩選檢測。

1.4.3CbPIN3基因的克隆 嚴格按試劑盒說明書步驟提取薺菜葉片RNA，采用甲醛變性膠電泳與核酸紫外分光光度計檢測其質(zhì)量與濃度，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)擬南芥PIN3基因(NM_105762.3)核苷酸序列，設(shè)計PCR克隆引物(表1)。

表1 研究所用引物

注：下劃線部分為酶切位點。

以薺菜cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL， PCR Buffer(10×) 2.5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 1 μL，引物CbPIN3-F/R (10 μmol/L)各1 μL，TaqDNA聚合酶1 U，補水至總體積25 μL。PCR反應(yīng)程序為: 95 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；最后72 ℃終末延伸10 min。將擴增產(chǎn)物切膠回收純化后，連接T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含有IPTG和X-gal的氨芐青霉素LB培養(yǎng)基上，挑選白色克隆。抽提質(zhì)粒，經(jīng)酶切檢測后送測序。

1.4.4CbPIN3生物信息學分析 采用NCBI BLAST在線分析CbPIN3基因核苷酸序列同源性；采用DNAStar軟件分析CbPIN3開放閱讀框、氨基酸序列組成、理化性質(zhì)；采用蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)(http://www.expsy/ch/tools)分析CbPIN3蛋白結(jié)構(gòu)特征；采用ClustalX與MEGA軟件構(gòu)建CbPIN3蛋白系統(tǒng)進化樹。

1.4.5CbPIN3組織表達分析 提取薺菜根、莖、葉、花、種子部位總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR檢測CbPIN3基因表達水平。擴增體系：cDNA 2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，SYBR Green Mix(2×)10 μL，補水至總體積20 μL。擴增程序：95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃終末延伸10 min。以β-actin為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt方法分析CbPIN3相對表達量。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP的構(gòu)建

鑒于薺菜與擬南芥心皮形態(tài)差異顯著(圖1)，為分析生長素在薺菜心皮發(fā)育中的作用，構(gòu)建了生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP，該系統(tǒng)包含DR5啟動子與GFP報告基因2個部分。首先人工體外合成DR5，連接到載體pBI121上，替換35S啟動子，然后將GFP基因構(gòu)建到載體pBI121上，雙酶切檢測GFP基因，最終成功構(gòu)建了生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP(圖2)。

A：薺菜成熟期心皮；B：擬南芥成熟期心皮；bar=1 mm

M：1 kb plus DNA分子質(zhì)量標準；1—3：pBI121-DR5∶∶GFP酶切結(jié)果

2.2 轉(zhuǎn)生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP薺菜植株的獲得

將構(gòu)建好的生長素報告載體pBI121-DR5∶∶GFP通過凍融法轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101中，農(nóng)桿菌通過花序侵染方式轉(zhuǎn)化野生型薺菜，收取轉(zhuǎn)基因薺菜種子，播種于盆裝培養(yǎng)土中，待長到2片真葉時噴灑50 mg/L的Kan進行篩選，得到具有抗性的轉(zhuǎn)基因植株(圖3)，溫室內(nèi)培養(yǎng)至成熟結(jié)種，單株收種子得到T1代種子。T1代種子經(jīng)消毒，春化后再次種植，經(jīng)過性狀分離篩選，得到T2代純合薺菜植株。提取Kan抗性薺菜總DNA，PCR法檢測GFP基因，結(jié)果4株擴增出GFP目標條帶(圖4)，最終成功獲得轉(zhuǎn)生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GFP薺菜植株。

圖3 轉(zhuǎn)基因薺菜Kan抗性篩選

M：1 kb plus DNA分子質(zhì)量標準；

2.3 轉(zhuǎn)基因薺菜心皮發(fā)育過程中生長素的檢測

熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因薺菜花器官的GFP熒光，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，薺菜花器官發(fā)育過程中生長素分布的特點如下：花瓣中觀察到較低的熒光信號；雄蕊產(chǎn)生較強的熒光信號；柱頭產(chǎn)生高強度的熒光信號；胚珠中有較弱的熒光信號(圖5)。

2.4 薺菜生長素輸出載體PIN3基因的克隆

在擬南芥的向性反應(yīng)中，PIN3動態(tài)分布參與生長素的極性運輸，包括側(cè)向運輸[14]。由于薺菜心皮發(fā)育中生長素的極性分布特點，通過RT-PCR方法獲得了1條2 000 bp的特異性條帶(圖6)。測序結(jié)果表明CbPIN3基因編碼區(qū)全長1 950 bp，BLAST比對發(fā)現(xiàn)，所克隆的序列與擬南芥、印度芥菜的PIN3基因及其他的PIN基因具有較高的同源性，表明已成功克隆了薺菜PIN3基因，命名為CbPIN3，并提交GenBank(JF966673)。

A：GFP在薺菜花瓣中表達；B：GFP在薺菜心皮兩側(cè)上端表達；C：GFP在薺菜雄蕊中表達；

M：1 kb plus DNA 分子質(zhì)量標準；

2.5 CbPIN3蛋白結(jié)構(gòu)分析

DNAStar軟件翻譯結(jié)果顯示，CbPIN3可編碼649個氨基酸(圖7)，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為70.00 ku，等電點為8.14。堿性氨基酸(K、R)個數(shù)為48；酸性氨基酸(D、E)個數(shù)為46；疏水氨基酸(A、I、L、F、W、V)個數(shù)為247；極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)個數(shù)為172；脂肪族氨基酸(I、L、V)個數(shù)為145；芳香族氨基酸(F、W、Y)個數(shù)為61。

在擬南芥中PIN家族關(guān)鍵位點的磷酸化修飾，對其發(fā)揮生長素極性運輸作用至關(guān)重要[15]。因此利用NetPhosBac 1.0 Server在線預測CbPIN3蛋白磷酸化情況，結(jié)果如圖8所示。CbPIN3蛋白存在13個絲氨酸磷酸化位點，1個蘇氨酸磷酸化位點，說明CbPIN3蛋白功能的發(fā)揮可能也需要磷酸化修飾。

跨膜結(jié)構(gòu)的存在對于生長素運輸載體發(fā)揮功能起著重要作用，因此預測了CbPIN3蛋白跨膜結(jié)構(gòu)情況。結(jié)果表明，CbPIN3具有9個跨膜結(jié)構(gòu)域，其中N端5個，C端4個。在C端還有一個整合蛋白，定位于質(zhì)膜的細胞外表面(ES)(圖9)。在線預測了CbPIN3亞細胞定位，結(jié)果顯示，CbPIN3在細胞膜上進行表達。

圖7 CbPIN3基因核苷酸序列及推測氨基酸序列

圖8 CbPIN3蛋白磷酸化位點預測

圖9 CbPIN3蛋白跨膜區(qū)預測分析

2.6 CbPIN3蛋白進化分析

為進一步分析CbPIN3蛋白與其他植物PIN3蛋白的進化關(guān)系，利用MEAG 5.1構(gòu)建PIN3系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖10A所示，CbPIN3與擬南芥PIN3(AtPIN3)親緣關(guān)系最近，進化樹上屬同一支；親緣關(guān)系最遠的是菠蘿PIN3(AcPIN3)。

進一步分析CbPIN3蛋白與擬南芥PIN3蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)二者同源性高達90%以上，二者N端和C端都具有幾乎一致的保守跨膜結(jié)構(gòu)域，區(qū)別主要在于中間環(huán)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)親水環(huán)數(shù)目的差異將擬南芥PIN蛋白分為長PIN蛋白與短PIN蛋白2個亞家族。在長PIN蛋白家族中，CbPIN3與AtPIN3親緣關(guān)系最近，在進化樹上同屬于一支；其次與AtPIN7關(guān)系較近；與AtPIN6親緣關(guān)系最遠(圖10B)。

2.7 CbPIN3組織表達分析

為分析CbPIN3基因表達模式，以qRT-PCR分析薺菜不同組織CbPIN3表達情況。如圖11所示，CbPIN3基因在薺菜根、莖、葉、花、果莢及種子中均有表達，但表達量具有組織差異性。其中，表達量最高的是莖，其次是根、葉及花，果莢中表達量最低，因此，推測CbPIN3可能參與調(diào)控薺菜莖、根、葉、花、果實等的發(fā)育過程。

A.CbPIN3蛋白進化樹分析；B.CbPIN3蛋白與擬南芥PIN蛋白進化關(guān)系

圖11 CbPIN3組織表達分析

3 結(jié)論與討論

作為植物的一種關(guān)鍵激素，生長素幾乎參與調(diào)控植物生長發(fā)育的各個方面，包括植物對光和重力的向性反應(yīng)、主根和側(cè)根的發(fā)育、頂端優(yōu)勢的維持、器官的建構(gòu)、維管組織的發(fā)育以及組織培養(yǎng)中的細胞生長等[16-18]。長久以來，由于無法直接顯示生長素在植物體內(nèi)的分布情況，因此影響了研究的進展。隨著分子生物學技術(shù)的進步，生長素誘導基因的發(fā)現(xiàn)是生長素研究史上一大重要突破，生長素早期響應(yīng)基因的啟動子區(qū)域包含多個生長素反應(yīng)元件，這些順式作用元件賦予其生長素響應(yīng)能力。通過對大豆GH3基因生長素反應(yīng)元件改造，人工構(gòu)建了生長素反應(yīng)元件DR5[19-20]，研究表明，DR5比天然的生長素反應(yīng)元件具有更強的生長素響應(yīng)能力，可提高5～10倍。DR5可調(diào)控報告基因GUS與GFP的表達，因此生長素報告系統(tǒng)DR5∶∶GUS、DR5∶∶GFP可用來在時間和空間上監(jiān)控植物體內(nèi)生長素的分布。DR5∶∶GUS/GFP已廣泛用于研究擬南芥、煙草、小立碗蘚、棉花、豌豆等多種植物生長發(fā)育過程，取得了非常顯著的效果[21-24]。

通過對轉(zhuǎn)基因薺菜花器官GFP熒光觀察，發(fā)現(xiàn)在薺菜花瓣中熒光信號較低，表明存在著低水平的生長素；雄蕊中具有較強的熒光信號，表明生長素在花粉囊中大量合成；柱頭上存在高強度熒光信號，推測雄蕊的伸長將生長素富集到花粉粒中，當花粉授到柱頭上時使柱頭維持高濃度的生長素水平；胚珠熒光信號較弱，表明生長素水平較低。這些結(jié)果均與擬南芥花器官發(fā)育中生長素分布情況類似，暗示薺菜和擬南芥花器官發(fā)育過程中生長素的分布有著較大的同源性。但二者也有不同：薺菜早期心皮上端兩側(cè)熒光信號較中間部分與下部強，而擬南芥的心皮中除柱頭外信號處于均勻分布。由此推測，在薺菜心皮的形態(tài)建成中，存在生長素向兩側(cè)上端橫向運輸?shù)臋C制，導致生長素的極性分布，加快細胞橫向分裂，最終發(fā)育成心形心皮形態(tài)。

生長素發(fā)育調(diào)控作用的發(fā)揮需要生長素的極性分布。PIN3作為PIN家族的一員，調(diào)控生長素的橫向運輸，參與擬南芥的向光、重力等向性反應(yīng)。本研究推測在薺菜的心皮發(fā)育中也存在生長素的橫向運輸，是否CbPIN3也參與了這一過程還未知，因此首先克隆了CbPIN3基因，分析了其蛋白結(jié)構(gòu)特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CbPIN3與擬南芥PIN3高度同源，具有類似的磷酸化位點、跨膜結(jié)構(gòu)域等。為進一步分析PIN3在薺菜生長發(fā)育中的作用，qRT-PCR分析了PIN3基因在薺菜不同組織的表達特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CbPIN3基因在薺菜多種組織中均表達，但表達量具有組織差異性。其中，莖中表達量最高，果莢中表達量最低，說明CbPIN3可能參與調(diào)控薺菜莖、根、葉、花、果實等多種器官的發(fā)育過程。

本研究利用生長素報告系統(tǒng)初步證實生長素參與了薺菜心形心皮的發(fā)育過程，其調(diào)控模式與Aloni等[25]、Sundberg等[5]利用DR5∶∶GUS/GFP系統(tǒng)研究擬南芥花器官發(fā)育過程生長素的分布結(jié)果較為一致，表明了薺菜與擬南芥心皮發(fā)育中生長素的極性分布差異導致了二者心皮形態(tài)迥異。此外，克隆了CbPIN3基因，發(fā)現(xiàn)PIN3蛋白與擬南芥PIN3蛋白高度同源，暗示其具備生長素橫向運輸能力。