HPLC測(cè)定胸腺素α1-胸腺五肽融合肽的含量

王彥厚，王鳳山

（1. 山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2. 淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086）

胸腺五肽（thymopentin，TP5）是位于胸腺生成素Ⅱ的第32～36位氨基酸殘基片段，也是胸腺生成素Ⅱ的活性中心，能雙向調(diào)節(jié)失衡的免疫系統(tǒng)，是一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑[1-2]。胸腺素α1（thymosin α1，Tα1）是一種天然存在于多種生物組織的多肽物質(zhì)，由28個(gè)氨基酸殘基組成[3]，作為免疫增強(qiáng)劑用于臨床[4-6]。TP5和Tα1具有相似的免疫調(diào)節(jié)活性，但TP5的體內(nèi)半衰期（t1/2）很短（約30 s），需要頻繁給藥才能維持療效；Tα1的體內(nèi)t1/2較長(zhǎng)（約100 min）。

為提高TP5的活性，延長(zhǎng)其體內(nèi)t1/2，本課題組前期借助基因工程方法，將具有相似生物活性與臨床用途的TP5 和Tα1連接在一起，采用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Tα1-TP5進(jìn)行融合表達(dá)，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝，成功進(jìn)行了中試規(guī)模的生產(chǎn)，獲得了Tα1-TP5融合肽。為更好地控制Tα1-TP5融合肽的質(zhì)量，建立了高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定胸腺素α1-胸腺五肽融合肽的含量，以保證該產(chǎn)品 的質(zhì)量和療效[7]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010C型高效液相色譜儀[島津（中國(guó)）]；UV2401PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[島津（中國(guó)）]；AB104型電子分析天平（梅特勒-托利多）；PHS-3C型精密pH計(jì)（上海儀電）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，Honeywell International Inc.）；磷酸（色譜純，上海阿拉?。?；無(wú)水磷酸氫二鈉（分析純，國(guó)藥集團(tuán)）；Tα1-TP5融合肽（山東金城生物藥業(yè)，批號(hào)：TT-20170601，TT-20170602，TT-20170603）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

精密稱取Tα1-TP5融合肽（批號(hào)：TT-20170601）10.36 mg，置于50 ml量瓶中，加水使溶解并定容至刻度，得溶液A；量取溶液A 5 ml，置于50 ml容量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，過(guò)濾，得樣品溶液。照中國(guó)藥典2015年版四部 通則0401紫外-可見(jiàn)分光光度法[7]，在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。本品的紫外吸收譜圖見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示：本品在208 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇208 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 Tα1-TP5融合肽的紫外吸收譜圖

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取Tα1-TP5融合肽（批號(hào)：TT-20170601）10.0 mg，置于10 ml量瓶中，加入流動(dòng)相搖勻使溶解，稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱為Agilent ZORBAX 80A Extend-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05 mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調(diào)pH至7.5）-乙腈（9:1，v/v）；流速為0.6 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為208 nm；進(jìn)樣量為20 μl。

2.4 方法學(xué)考察

圖2 空白溶劑液相色譜圖

圖3 供試品溶液HPLC色譜圖

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取蒸餾水（空白溶液）、供試品溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。結(jié)果表明：供試品溶液中，7.42 min為主成分峰，檢出3個(gè)雜質(zhì)峰，出峰時(shí)間分別為4.10，5.62，10.08 min。表明本方法專屬性良好，溶劑不干擾樣品的檢測(cè)，能滿足含量測(cè)定的要求。

2.4.2 線性關(guān)系試驗(yàn) 精密稱取Tα1-TP5融合肽（批號(hào)：TT-20170601）19.1 mg，置于10 ml量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備溶液；分別精密量取貯備溶液1 ml，加適量流動(dòng)相，制成濃度分別為0.479，0.766，0.957，1.126，1.367 mg/ml的溶液，備用。按2.3項(xiàng)色譜條件，精密量取以上各濃度溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，以濃度為橫坐標(biāo)（C），峰面積為縱坐標(biāo)（A），進(jìn)行線性回歸，并求出線性方程，結(jié)果表明：Tα1-TP5融合肽在0.479～1.367 mg/ml濃度范圍內(nèi)，濃度（C）與峰面積（A）線性關(guān)系良好（r=0.9998）。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密量取供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量20 μl，記錄色譜圖，Tα1-TP5融合肽主成分峰面積的RSD（n=6）為0.44 %。表明本法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份Tα1-TP5融合肽（批號(hào)：TT-20170601）10.0 mg，分別置于10 ml量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。精密量取上述供試品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明：6份供試品溶液中，雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、主成分、雜質(zhì)3、總雜質(zhì)的平均峰面積歸一化法計(jì)算含量分別為0.314 %，0.049 %，98.831 %，0.807 %，1.170 %，RSD分別為3.78 %，8.97 %，0.04 %，3.73 %，3.10 %，均小于10 %。表明采用本法測(cè)定Tα1-TP5融合肽的含量，重復(fù)性良好。

2.7 檢出限和定量限

量取2.4.2 項(xiàng)下濃度為0.479 mg/ml的溶液適量，配制成不同濃度的系列稀釋溶液，分別量取各稀釋溶液20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。當(dāng)Tα1- TP5融合肽的濃度為0.957 μg/ml，進(jìn)樣量為20 μl時(shí)，S/N=10.73，表明采用本法測(cè)定Tα1-TP5融合肽含量的定量限為19.14 ng/ml；當(dāng)Tα1-TP5融合肽的濃度為0.319 μg/ml，進(jìn)樣量為20 μl時(shí)，S/N=3.76，表明采用本法測(cè)定Tα1-TP5融合肽含量的檢出限為6.38 ng/ml。

2.8 溶液穩(wěn)定性

將供試品溶液置于約30 ℃條件下放置，分別于第0，3，6，12 h取樣，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。雜質(zhì)1、雜質(zhì)2、主成分、雜質(zhì)3含量RSD分別為8.94 %，21.48 %，0.09 %，5.91 %，結(jié)果表明室溫下放置12 h內(nèi)，供試品溶液中雜質(zhì)1和雜質(zhì)2含量有增加趨勢(shì)，含量間RSD分別為8.94 %，21.48 %，顯示供試品溶液在室溫條件下不穩(wěn)定，溶液須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.9 樣品測(cè)定

分別取3批Tα1-TP5融合肽（批號(hào)：TT-20170601，TT-20170602，TT- 20170603），按2.2項(xiàng)方法配制供試品溶液，按2.3項(xiàng)色譜條件，以歸一化法計(jì)算樣品的含量分別為98.76 %，98.34 %，98.90 %。

3 討論

本文對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了考察。采用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）-甲醇（90:10）為流動(dòng)相，在記錄時(shí)間內(nèi)未檢測(cè)出有效峰；采用磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）-甲醇（70:30）為流動(dòng)相，檢測(cè)出有效峰，但基線噪音較大；分別以水-甲醇（70:30）、水-甲醇（90:10）為流動(dòng)相，檢測(cè)出有效峰，但出峰時(shí)間較靠前，與溶劑峰重合；以磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）-乙腈（90:10）為流動(dòng)相，檢測(cè)出有效峰，且主峰和相鄰雜質(zhì)分離度較好，雜質(zhì)也可有效檢出，故選擇此條件進(jìn)行試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)中考察了Agilent ZORBAX 80A Extend-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和超寬pH耐受范圍（pH 1.0～12.5）的Welch Xtimate-C18柱（150 mm×4.6 mm，3 μm），不同流速（0.5，0.6，0.7 ml/min），不同流動(dòng)相pH值（7.0，7.5，8.0）條件下的分離效果。結(jié)果顯示各條件下均能取得良好的分離效果，采用峰面積歸一化法計(jì)算含量結(jié)果基本一致。此方法色譜峰分離度好，峰形良好，保留時(shí)間適中，適用于Tα1-TP5融合肽含量測(cè)定。