12種培美曲塞新型衍生物的抗菌活性分析

劉 秀, 賈玉萍，賈慶文，馬玉奎，郭中坤,3，王可洲,3*

（1. 濟南大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250200；2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟南250101；3. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 山東省實驗動物中心，山東 濟南 250002）

二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）抑制劑能選擇性地與DHFR結(jié)合，阻止或抑制正常底物與之結(jié)合，從而阻礙機體細胞生長和繁殖所必須的物質(zhì)──葉酸的正常代謝，最終導(dǎo)致腫瘤細胞死亡，從而達到治療腫瘤的目的[1]。培美曲塞（pemetrexed，PMX）作為常用的DHFR抑制劑之一，主要用于惡性胸膜間皮瘤及非小細胞肺癌的二線治療[2-3]。有研究顯示，某些抗腫瘤藥物有可能兼有抗菌作用[4-5]。通常被用作抗腫瘤藥的培美曲塞及其衍生物的抗菌活性目前少有報道。本研究選擇12種DHFR抑制劑類培美曲塞衍生物，采用優(yōu)化后的MTT法檢測其對大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、白色念珠菌（Candida albicans）的半數(shù)最低抑菌濃度（half maximal inhibitory concentration，MIC50）及最低殺菌濃度（minimal bactericical concentration，MBC），并以此為指標來評價待測化合物的抗菌活性，篩選出具有抗菌活性的化合物以便進一步研究開發(fā)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

12種培美曲塞衍生物（A1～A12，山東省藥學(xué)科學(xué)院）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，青島海博生物）；0.9 %氯化鈉注射液（辰欣藥業(yè)）；溴化噻唑藍四氮唑（MTT，Biosharp公司）；DMSO（分析純，國藥集團）；青鏈霉素混合液（100×，Solarbio公司）；培美曲塞二鈉（PMX，天津德太然生物醫(yī)藥）。

1.2 儀器

Spx-250B-Z型生化培養(yǎng)箱（上海博迅）；HF safe-1500TE生物安全柜（上海力申）；Spectra Max I3多功能酶標儀（美國MD公司）；JW-1032常溫低速離心機（安徽嘉文）。

1.3 試驗菌株

大腸桿菌（8099），金黃色葡萄球菌（ATCC6538），白色念珠菌（ATCC10231），由山東省實驗動物中心實驗室提供。

2 方法

2.1 菌懸液制備

將保存于-80 ℃的甘油凍存菌種采用平板劃線法接種于相應(yīng)培養(yǎng)基平皿中培養(yǎng)（各菌株所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件[6]見表1）后，挑取生長良好的單菌落于相應(yīng)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

表1 各菌株所用培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

2.2 適于抗菌活性測定的MTT法的建立[7]

2.2.1 最適檢測波長及DMSO用量的確定 將菌懸液用0.9 %氯化鈉注射液按1:2、1:4比例稀釋后，取原液和稀釋菌液加入96孔板，每孔100 μl，之后加入20 μl MTT溶液，將菌株置于恒溫培養(yǎng)箱（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為37 ℃，白色念珠菌為28℃）中培養(yǎng)60 min后，1000 r/min離心10 min，小心吸去上清，各加入0，100，150 μl DMSO溶解MTT溶液與細菌形成的甲臜結(jié)晶，震蕩5 min，用酶標儀測定其在400～700 nm范圍內(nèi)每隔50 nm的光密度值（OD），以O(shè)D值最大時的檢測波長作為最適檢測波長。同時設(shè)置空白孔及調(diào)零孔，各濃度至少3個平行。

2.2.2 最適細菌濃度的確定 取3種菌株處于對數(shù)生長期的菌懸液，用適量0.9 %氯化鈉注射液稀釋至1×109cfu/ml后，再10倍系列稀釋8個梯度，測定

2.3 抗菌活性測定

2.3.1 測定MIC50利用建立的MTT法測定抗菌活性，具體步驟如下：將培養(yǎng)好的菌液10倍系列稀釋至107cfu/ml左右，取100 μl加至96孔板。稱取適量待測化合物（A1～A12）及PMX，配制成200 mmol/L的母液，再用液體培養(yǎng)基梯度稀釋，各取100 μl加至相應(yīng)孔中，使終濃度分別為200，40，8，1.6，0.32 μmol/L，每組設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照孔、陽性對照孔[青鏈霉素混合液（1×）]，96孔板四周孔用液體培養(yǎng)基填充。加藥完畢，96孔板置于相應(yīng)培養(yǎng)溫度中培養(yǎng)20 h（真菌44 h）后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將96孔板從培養(yǎng)箱中拿出，1000 r/min離心10 min，小心吸去上清，加入DMSO 100 μl，震蕩5 min。用酶標儀測定震蕩之后的96孔板在500 nm處的光密度值（OD500）。用下式計算待測化合物對細菌/真菌的抑制率（%）：

抑制率（%）=[1-（加藥組OD500-調(diào)零孔OD500）/（空白對照組OD500-調(diào)零孔OD500）]×100 %

2.3.2 MBC測定[9]MIC50測定同時，取未見明顯渾濁的孔內(nèi)培養(yǎng)物10 μl于1.5 ml離心管中，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋100倍混勻后，吸取100 μl涂布于事先準備好的TSA或SDA平板上培養(yǎng)，未見菌落數(shù)生長或平均菌落數(shù)小于10個的最小稀釋度的藥物濃度即為其MBC。

2.4 數(shù)據(jù)分析

3 結(jié)果

3.1 建立適于抗菌活性測定的MTT法

3.1.1 最適檢測波長及DMSO用量測定結(jié)果 MTT溶液與大腸桿菌形成的甲臜結(jié)晶經(jīng)DMSO溶解后，在450～600 nm范圍內(nèi)有較寬廣的吸收峰，且不同濃度菌液的吸收峰均在500 nm左右，而沒有用DMSO溶解的甲臜，其吸收峰在650 nm左右；MTT與金黃色葡萄球菌形成的甲臜經(jīng)DMSO溶解后，在450～550 nm范圍內(nèi)有較寬廣的吸收峰，且有明顯的特征性吸收峰，不同濃度菌液的吸收峰均在500 nm左右，而沒有用DMSO溶解的甲臜，其吸收峰在600 nm左右；MTT與白色念珠菌形成的甲臜經(jīng)DMSO溶解后，在400～550 nm范圍內(nèi)有較寬廣的吸收峰，沒有明顯的特征性吸收峰。以上結(jié)果提示：是否使用DMSO對于實驗結(jié)果有較大影響；不同用量的DMSO得到的吸收峰特征圖較為一致，且各OD值接近，說明使用100 μl的DMSO能將甲臜充分溶解。同時，菌液濃度過高時，得到的OD值較大，線性關(guān)系不好且特征性吸收峰不明顯，因此，菌液的使用濃度不宜過高。

3.1.2 確定測量范圍 不同濃度梯度菌液的OD570均值見表2。由表2可見，大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的菌液濃度為10，102，103，104，105，106cfu/ml時，6組數(shù)據(jù)兩兩之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但均與107，108cfu/ml組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；且107，108cfu/ml 2組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由此可見，當菌液濃度低于106cfu/ml時，對OD570值的影響不顯著，因此，在進行MTT檢測時，大腸桿菌及金黃色葡萄球菌菌液的檢測范圍為107～108cfu/ml，白色念珠菌菌液的檢測范圍則為106～108cfu/ml。

表2 不同濃度梯度菌液的OD570均值

3.2 抗菌活性測定結(jié)果

MTT法檢測結(jié)果表明，12種培美曲塞衍生物對大腸桿菌及白色念球菌均無抑制作用，化合物A4、A7、A11、A12對金黃色葡萄球菌有良好的抑制效果，MIC50分別為7.05±4.67，1.11±0.2，14.12±0.54，9.86±2.31 μmol/L，并且當這4種化合物的終濃度為200 μmol/L時，對細菌的抑制率分別為97.15 %，98.21 %，97.12 %，97.80 %，均強于青鏈霉素混合液（1×）對金黃色葡萄球菌的抑制率（96.76 %）。其中，A7的抑制效果最強，且重復(fù)性較好。以上結(jié)果提示：此類系列藥物中某些化合物可能對某些革蘭陰性菌及真菌無效，對某些革蘭陽性菌有效。結(jié)果見表3。

表3 12種培美曲塞衍生物對不同菌種的MIC50及MBC

4 討論

四甲基偶氮噻唑藍比色法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。目前，該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、抗腫瘤藥物的大規(guī)模篩選、細胞毒性檢測及腫瘤放射敏感性測定等領(lǐng)域[10-14]。藥物對細菌的作用檢測方面少見報道。本研究發(fā)現(xiàn)細菌與MTT形成的甲臜在450～600 nm 處有較寬的吸收峰，在500 nm處有最大吸收峰，該結(jié)果與已有的實驗結(jié)果基本吻合[7,15]。通過對部分條件進行優(yōu)化，完善了用于抗菌活性測定的MTT法[16-17]，這為之后藥物抑菌活性的研究奠定了基礎(chǔ)。同時，優(yōu)化后的MTT法結(jié)果表明：部分培美曲塞衍生物具有抗腫瘤作用的同時，兼有抗菌活性[18-19]。此結(jié)果提示我們，此類藥物發(fā)揮抗腫瘤作用的機制是否與其抗菌活性有關(guān)、其他類型的DHFR抑制劑是否也具有抗菌活性等藥理作用還需要進一步研究，以期發(fā)現(xiàn)新的藥理活性，為臨床合理用藥提供可能。