（山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟南 250101）

黃蜀葵花為錦葵科植物黃蜀葵Abelmoschus manihot(L.) Medic.的干燥花冠，作為藥用始于宋代[1]，收載于《中國藥典》2015年版一部，在民間有較多應(yīng)用?！都斡颖静荨酚涊d黃蜀葵花“甘、寒、滑、無毒，主治小便淋及催生，治諸惡瘡、膿水久不痤者，作末敷之即愈，為瘡家要藥”?！侗静菥V目》記載“消癰腫，浸油，涂湯火傷”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃蜀葵花總黃酮具有良好的清熱利濕解毒功效，進一步藥理試驗研究顯示黃蜀葵花總黃酮具有明顯的抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛、抗病毒及促進愈合等藥理作用[2-6]。

在質(zhì)量控制方面，《中國藥典》2015年版一部收載的黃蜀葵花藥材僅規(guī)定了單一成分金絲桃苷的含量測定方法及含量限度，未制定總黃酮含量測定方法及含量限度；《山東省中藥材標準（2012年版）》中黃蜀葵花項下亦未制定總黃酮含量測定方法及含量限度；《江蘇省中藥材標準（1989年版）增補本》中收載的黃蜀葵花藥材總黃酮含量測定是采用蘆丁為對照，以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法進行測定，該方法也是黃酮類成分含量測定最常用的方法。但由于黃蜀葵花藥材本身不含蘆丁，相似結(jié)構(gòu)的黃酮雙糖苷成分在藥材中含量又極低，因此以蘆丁為對照品的測定方法不夠準確合理。隨著對黃蜀葵花化學(xué)成分研究的深入，其主要含有的黃酮成分是以金絲桃苷為代表的黃酮單糖苷化合物，且金絲桃苷也被證實是其抗炎鎮(zhèn)痛的有效成分[7-8]，因此近年對黃蜀葵花總黃酮含量測定的研究主要集中在以金絲桃苷為對照品，采用各種不同顯色劑顯色后進行含量測定。

文獻[9]報道了采用金絲桃苷為對照品，對亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色（B法）、不顯色直接測定（C法）、醋酸醋酸鈉緩沖液-三氯化鋁顯色（D法），及采用蘆丁為對照品、亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色（A法）4種方法進行了比較研究，認為D法（醋酸醋酸鈉緩沖液-三氯化鋁顯色）測定黃蜀葵花中總黃酮含量相對準確；而以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色（B法）時，藥材所含的槲皮素-3’-葡糖苷、棉皮素-3’-葡糖苷和楊梅素不顯紅色，因此，B法造成測得的總黃酮含量偏低；而不顯色直接測定（C法）由于藥材中鞣質(zhì)含量較高，在同一波長258 nm處有很強的紫外吸收，導(dǎo)致C法測定結(jié)果偏高；以蘆丁為對照品的亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法（A）法測定結(jié)果不及以金絲桃苷為對照測定結(jié)果合理準確。

目前隨著黃蜀葵花研究的逐步深入，及中醫(yī)臨床應(yīng)用的日漸廣泛，為尋求一種切實可行、簡便準確的黃蜀葵花總黃酮含量測定方法，我們對上述C法及D法進行了比較研究，研究確定了一種黃蜀葵花總黃酮含量測定的最佳方法。

1 儀器與試藥

Agilent 8453 UV-Vis分光光度計（美國安捷倫）；Mettler AE200分析天平（瑞士梅特勒-托利多）；金絲桃苷對照品（中國食品藥品檢定研究院）；黃蜀葵花藥材經(jīng)鑒定為黃蜀葵Abelmoschus manihot(L.) Medic.的干燥花冠。所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 醋酸醋酸鈉緩沖液-三氯化鋁顯色測定

2.1.1 供試品溶液的制備 取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加75 %乙醇提取6 h，提取液置100 ml量瓶中，加乙醇至刻度，備用。

2.1.2 對照品溶液的制備 取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1 ml含金絲桃苷80μg的溶液，即得。

2.1.3 測定波長的選擇 取對照品溶液3 ml，供試品溶液1 ml，分別置25 ml量瓶中，分別加水至5.0 ml，精密加入醋酸-醋酸鈉緩沖液（2 mol/L醋酸溶液:2 mol/L醋酸鈉溶液=3:1）5.0 ml和0.1 mol/L三氯化鋁溶液3.0 ml，加水定容至刻度，搖勻，放置40 min；取水5.0 ml，同法制得空白對照溶液。200～800 nm范圍內(nèi)掃描吸收曲線。結(jié)果表明，金絲桃苷對照品溶液與黃蜀葵花藥材供試品溶液的最大吸收波長不一致，對照品溶液最大吸收為398 nm，而供試品溶液最大吸收為412 nm。

2.1.4 黃蜀葵花藥材總黃酮含量測定結(jié)果 分別以398 nm和412 nm作為測定波長，測定了黃蜀葵花藥材總黃酮含量，結(jié)果見表1。

表1 黃蜀葵花藥材不同波長測定總黃酮含量結(jié)果

試驗結(jié)果表明，不同波長測定的黃蜀葵花藥材總黃酮含量相差約10 %。

2.2 不顯色直接測定（C法）

2.2.1 供試品溶液的制備 取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，備用。

2.2.2 對照品溶液的制備 取金絲桃苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含金絲桃苷80 μg的溶液，即得。

2.2.3 測定波長的選擇 取對照品溶液3 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻；取供試品溶液1 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻；以50 %甲醇為空白，在200～800 nm范圍內(nèi)掃描吸收曲線。結(jié)果表明，金絲桃苷對照品與黃蜀葵花藥材供試品溶液在257 nm波長處均有相同的最大吸收。

2.2.4 黃蜀葵花藥材總黃酮含量測定結(jié)果 精密量取對照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，分別置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻。以50 %甲醇為空白，在256 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。精密量取供試品溶液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，在256 nm處測定吸光度，按標準曲線計算供試品溶液中金絲桃苷的量，測得總黃酮含量為5.08 %。

2.3 C法和D法測定不同來源黃蜀葵花藥材含量比較

取不同來源黃蜀葵花藥材，分別采用不顯色直接測定（C法）、醋酸醋酸鈉緩沖液-三氯化鋁顯色（D法，398 nm波長）測定總黃酮含量，結(jié)果見表2。

表2 不同來源黃蜀葵花藥材總黃酮含量測定結(jié)果

結(jié)果表明，C法和D法測定不同來源黃蜀葵花藥材總黃酮含量相差約6 %～8 %。C法較D法具有操作簡便的特點，因此選擇C法作為黃蜀葵花總黃酮含量測定方法。

2.4 不顯色直接測定（C法）的供試品溶液制備方法優(yōu)選

采用不顯色直接測定法，進一步對黃蜀葵花藥材供試品溶液的制備方法，包括提取方法、提取時間及提取溶劑進行了優(yōu)選和比較。

2.4.1 不同提取方法黃蜀葵花藥材總黃酮含量比較 對比索氏提取和回流提取法制備的總黃酮含量進行比較。

索氏提?。悍Q取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚（60～90℃）80 ml，加熱回流1 h，棄去石油醚液，藥渣揮干，加入甲醇80 ml，加熱回流5 h，將甲醇轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為索氏提取的供試品溶液。

回流提?。悍Q取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為回流提取的供試品溶液。

分別精密吸取上述供試品溶液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項方法測定總黃酮含量，結(jié)果見表3。

表3 黃蜀葵花藥材不同提取方法總黃酮含量測定結(jié)果

結(jié)果表明，兩種提取方法總黃酮含量無明顯差異，回流操作簡便，耗時短，效率高。

2.4.2 不同提取時間黃蜀葵花總黃酮含量比較 稱取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，分別加熱回流1，2，3 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，分別精密吸取續(xù)濾液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項方法測定總黃酮含量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，提取1 h總黃酮含量較低，提取2 h與3 h總黃酮含量無明顯差別，說明2 h即可提取完全。

表4 黃蜀葵花藥材不同提取時間總黃酮含量測定結(jié)果

2.4.3 不同提取溶劑黃蜀葵花總黃酮含量比較 分別取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別精密加入甲醇，乙醇100 ml，分別稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用相應(yīng)溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，分別精密吸取續(xù)濾液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項方法測定總黃酮含量，結(jié)果見表5。

表5 黃蜀葵花藥材不同提取溶劑總黃酮含量測定結(jié)果

結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑，提取物中總黃酮含量較高。

2.4.4 聚酰胺柱除雜對提取物總黃酮含量的影響比較 取黃蜀葵花藥材粉末0.5 g，共取2份，分別精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇100 ml，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，一份精密吸取續(xù)濾液1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項方法測定總黃酮含量；另一份精密量取續(xù)濾液10 ml，蒸干，殘渣加水5 ml分次溶解，加至聚酰胺柱（60～90目，1.0 g，內(nèi)徑1.0 cm），用70 %甲醇50 ml洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取1.0 ml，置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項方法測定總黃酮含量。結(jié)果見表6。

表6 黃蜀葵花藥材不同純化處理總黃酮含量測定結(jié)果

結(jié)果表明，經(jīng)聚酰胺柱純化后的總黃酮含量與未經(jīng)聚酰胺柱純化無明顯差異。

2.5 不顯色直接測定（C法）的含量測定方法學(xué)考察

2.5.1 標準曲線和線性范圍 取金絲桃苷對照品約8 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取2.5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1 ml含金絲桃苷80 μg）。精密量取對照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，分別置25 ml量瓶中，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，以50 %甲醇作為空白，256 nm波長處測定吸光度（A），以吸光度為縱坐標，濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。回歸方程：A=-6.3996×10-5＋2.2938×10-2C，r=0.99980，表明金絲桃苷在0.003132～0.018792 mg/ml范圍內(nèi)與其吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗 精密量取對照品和供試品溶液，按2.2.4項方法操作，并依法測定放置不同時間的吸光度，對照品溶液吸光度RSD為0.54 %，供試品溶液吸光度RSD為0.52 %，表明樣品在80 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.3 精密度試驗 取金絲桃苷對照品8 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲處理使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5 ml，置25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別精密量取對照品溶液4.0 ml（共5份），置25 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，按2.2.4項方法操作，測定吸光度（A），計算RSD=0.39 %；同一對照品溶液連續(xù)測定5次吸光度，計算RSD=0.28 %，說明該方法有較好的精密度。

2.5.4 重復(fù)性試驗 取黃蜀葵花藥材粉末6份，每份0.5 g，精密稱定，按2.2.1項方法制備供試品溶液并按2.2.4項方法測定總黃酮含量，結(jié)果見表7。

表7 重復(fù)性試驗測定結(jié)果

2.5.5 回收率試驗 取黃蜀葵花藥材粉末（總黃酮含量為5.10 %）6份，每份0.25 g，精密稱定，分別精密加入金絲桃苷對照品約12 mg，按2.2.1項方法制備供試品溶液并按2.2.4項方法測定總黃酮含量，計算回收率，結(jié)果見表8。

表8 加樣回收率試驗結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 本試驗對兩種黃蜀葵花藥材總黃酮含量測定方法C法及D法進行了深入研究，結(jié)果表明C法和D法測定總黃酮含量相差6 %～8 %，與文獻[9]報道的兩種方法測定結(jié)果相同。

3.2 2006年文獻[9]報道的C法和D法測定總黃酮含量相差6 %～8 %，分析是由于黃蜀葵花藥材中的鞣質(zhì)干擾總黃酮含量測定，導(dǎo)致C法測定結(jié)果偏高。本試驗結(jié)果表明，二者測定結(jié)果存在差異的原因為：首先，D法對照品溶液與供試品溶液的最大吸收波長不一致，對照品溶液最大吸收波長為398 nm，而供試品溶液的最大吸收波長為412 nm，導(dǎo)致測得的總黃酮含量偏低2 %～3 %；其次，D法采用乙醇為提取溶劑，研究結(jié)果顯示，與甲醇相比，乙醇提取總黃酮含量低約5 %；再次，進一步測定了黃蜀葵花藥材中鞣質(zhì)的含量，結(jié)果表明其鞣質(zhì)含量約1 %～2 %。

3.3 經(jīng)聚酰胺柱純化后的供試液測得總黃酮含量與未經(jīng)聚酰胺柱純化測定結(jié)果無明顯差異。

3.4 此外研究發(fā)現(xiàn)，D法采用的索氏提取操作繁瑣，耗時6個多小時，而C法采用回流提取僅需2 h，兩種提取方法總黃酮含量無明顯差異，回流提取明顯縮短了供試品溶液的制備時間，提高了工作效率。

綜上，試驗結(jié)果表明，C法具有供試液與對照品金絲桃苷最大吸收一致，無需加入醋酸-醋酸鈉緩沖液、三氯化鋁等顯色劑，操作簡便及穩(wěn)定性好的特點，且具有很好的準確性和精密度，為目前測定黃蜀葵花藥材及其制劑中總黃酮含量的最佳測定方法。