相偉芳，李 敏，林艷平，王 靜，張新玥，郭美琪，楊藝新,朱耿平，潘麗娜*

1天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387；3漯河市豫中南林業(yè)有害生物天敵繁育研究中心，河南 漯河 462300

嗅覺是昆蟲至關重要的感覺系統(tǒng)，昆蟲利用嗅覺系統(tǒng)辨別其偏好的氣味成分，繼而引起特定的生理和行為反應，如定位寄主、探求配偶、交配、產(chǎn)卵、躲避天敵等(Webster & Cardé,2016)。通過研究昆蟲嗅覺機制，將為調(diào)控昆蟲行為、防控害蟲侵襲、保護和利用有益昆蟲奠定基礎。近30年來，人們對昆蟲嗅覺分子機制的有了相對深入的了解，主要過程可以概括為氣味分子可以通過昆蟲的嗅覺感器(sensillum)進入感器淋巴液中，與其中的氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)結(jié)合并將其傳遞給氣味受體(odorant receptors,ORs)。氣味受體在接受氣味分子后引起機體產(chǎn)生一系列的嗅覺反應(Vogt & Riddiford，1981)。由于OBPs對氣味分子的選擇具有相對的專一性，每一種OBP只能結(jié)合一定類別的氣味分子，對氣味分子起到初步的過濾作用，是昆蟲嗅覺識別過程中非常關鍵的一步(Cuietal.,2016; Leal,2013)。因此,OBPs與氣味分子的結(jié)合特性是本領域的研究熱點，而分子對接技術(molecular docking)是近年來被應用于研究OBPs功能的新興技術(Lietal.,2017)。

分子對接是根據(jù)Fisher于1894年提出的的理論模型“鎖—鑰原理”(lock and key principle)來模擬小分子配體與大分子受體間相互作用的一種方法。配體與受體的作用是分子識別的過程，主要通過氫鍵作用、疏水作用及范德華力等結(jié)合。通過計算，可以預測兩者間結(jié)合的親和力和結(jié)合模式，從而可以篩選出與大分子受體結(jié)合的小分子配體(Georgeetal.,2014)。由于可以實現(xiàn)快速精準對接，很大程度上減少配體小分子的篩選數(shù)量及時間，提高篩選效率和準確性。目前，分子對接技術已經(jīng)被應用于多個領域，如生物大分子的修飾和藥物設計等(許先進和王存新，1989)。2010年，分子對接技術開始應用于昆蟲嗅覺機制領域(Heetal.，2010)。此后，該技術在此領域得到了廣泛的應用，如Zhangetal.(2018)對茶尺蠖EctropisobliquaWarren氣味結(jié)合蛋白OBP2、Wangetal.(2017)對紫榆葉甲AmbrostomaquadriimpressumMotsch氣味結(jié)合蛋白AquaOBP4、Sunetal.(2017)對苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus(Goeze)氣味結(jié)合蛋白OBP6的結(jié)合特性均進行了研究。

美國白蛾Hyphantriacunea(Drury)是重大外來入侵害蟲，屬鱗翅目燈蛾科，是一種食性雜、繁殖量大、適應性強、傳播途徑廣、危害嚴重的世界性檢疫害蟲(季榮等，2003; 楊忠歧和張永安，2007；張向欣和王正軍，2009)。1979年首次在我國遼寧丹東發(fā)現(xiàn)，隨后擴散至山東、陜西、河北、天津等地，對我國農(nóng)林業(yè)造成了嚴重危害(黃頂成和張潤志，2011; 楊忠岐和張永安2007)。楊忠岐(1989)在我國發(fā)現(xiàn)和篩選出了寄生美國白蛾的特優(yōu)天敵——白蛾周氏嚙小蜂ChouioiacuneaYang。白蛾周氏嚙小蜂屬姬小蜂科嚙小蜂屬，寄生在美國白蛾的蛹中，對美國白蛾種群起到很好的控制作用(楊忠岐等，2005；鄭雅楠等，2012)。目前已經(jīng)廣泛應用于美國白蛾的防治中，并取得顯著成效。

本課題組前期對美國白蛾蛹、蟲糞和老熟幼蟲所釋放的揮發(fā)性化合物進行了測定，共檢測出了11種物質(zhì)(Zhuetal.，2016)；Zhaoetal.(2016)通過轉(zhuǎn)錄組測序技術對雌雄白蛾周氏嚙小蜂觸角進行了測序，共測定出25個氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins，OBPs)、80個氣味受體(odorant receptors，ORs)、10個離子受體(ionotropic receptors，IRs)、11個化學感受蛋白(chemosensory proteins，CSPs)、1個神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins，SNMPs)和17個味覺受體(gustatory receptors，GRs)；王鳳竹等(2017)、張新玥等(2018)通過實時熒光定量PCR檢測及RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)了一些主要在雌雄觸角上大量表達的蛋白，推測這些蛋白的功能可能直接與尋找寄主相關，對白蛾周氏嚙小蜂CcOBP1和非典型性氣味受體CcOr83b基因進行了多角度的進化分析。本研究擬選取一個主要在雌性觸角大量表達的蛋白CcOBP1，通過分子對接技術，研究與11種寄主揮發(fā)物的結(jié)合特性，從而確定CcOBP1的功能，為白蛾周氏嚙小蜂的嗅覺分子機制研究積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白蛾周氏嚙小蜂OBP1同源建模及模型評價

根據(jù)已經(jīng)得到的白蛾周氏嚙小蜂CcOBP1全序列，通過BioEdit將序列轉(zhuǎn)化成氨基酸序列作為建模模板，在Swiss-Model(http:∥swissmodel.expasy.org/)對CcOBP1進行同源建模，獲得該蛋白的三維結(jié)構(gòu)。用Ramachandran圖(Ramachandranetal.,1963)評價CcOBP1蛋白三維結(jié)構(gòu)的質(zhì)量。

1.2 白蛾周氏嚙小蜂OBP1蛋白的分子對接

前期對美國白蛾蛹、老熟幼蟲及蟲糞的揮發(fā)物進行了鑒定，一共得到了11種化合物(表1)。將這11種化合物用于CcOBP1分子對接，從Pubchem(https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載這11種小分子的三維結(jié)構(gòu)。用Schrodinger Suites 2015-2中的maestro 10.2軟件進行分子對接：通過maestro 10.2軟件導入已構(gòu)建好的白蛾周氏嚙小蜂OBP1的三維結(jié)構(gòu)，用Discovery Studio 4.5 Visualizer軟件打開該三維結(jié)構(gòu)，手動輸入具體坐標，可進行適當調(diào)整，使白蛾周氏嚙小蜂OBP1的活性中心位于盒子中心，生成文件保存；導入已經(jīng)下載好的小分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)，進行小分子其他構(gòu)象的搜索，保存生成的文件；用maestro 10.2進行分子對接，Pymol v1.3顯示對接結(jié)果。

表1 小分子物質(zhì)的名稱及CAS號Table 1 Names and CAS numbers of small molecular substances

2 結(jié)果與分析

2.1 白蛾周氏嚙小蜂OBP1同源建模分析

利用Swiss-Model在線搜素白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP1最佳模型的模板，結(jié)果表明，意大利蜜蜂Apismellifera的氣味結(jié)合蛋白OBP14(Spinellietal.,2012)(ID:3s0g.1)的相似度最高，因此將意大利蜜蜂的氣味結(jié)合蛋白OBP14作為白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP1的模板，通過Swiss-Model構(gòu)建白蛾周氏嚙小蜂CcOBP1結(jié)構(gòu)模型(圖1)。白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP1的三維結(jié)構(gòu)包括Pro20-Asn36(α1)、Ala4154-Arg48(α2)、Asp61-Lys70(α3)、Glu82-Lys88(α4)、Leu93-Ala105(α5)、Ser112-Ala116(α6)，6個α螺旋結(jié)構(gòu)。

拉式構(gòu)象(ramachandran)圖結(jié)果顯示，90.6%CcOBP1氨基酸殘基落在最佳區(qū)域，8.5%的氨基酸殘基落在較合理區(qū)域，只有0.9%的氨基酸殘基落在不允許區(qū)域(圖2)。有90.6%CcOBP1氨基酸殘基落在最佳區(qū)域，大于90%，說明這個蛋白模型較為合理，可以用于后續(xù)的分子對接中。

圖1 白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白Cc OBP1結(jié)構(gòu)圖Fig.1 3D structures of odorant binding protein1 of C.cuneaA:CcOBP1與意大利蜜蜂的氣味結(jié)合蛋白OBP14(ID:3s0g.1)的序列比對,完全相同的殘基以紅色字體、黃色背景突出；B:白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP1三維結(jié)構(gòu)圖。A:Sequence alignment of CcOBP1 with OBP14 from A.mellifera (PDB ID:3S0g.1); α-helices are displayed as helix.Strictly identical residues are highlighted in red letters with yellow background; B:The 3D structures of CcOBP1.

圖2 白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP1Ramachandran圖Fig.2 Rational evaluation of the established 3D model of CcOBP1 by Ramachandran plot藍色區(qū)域表示氨基酸殘基位于最佳區(qū)域(90.6%)，紫色區(qū)域表示較合理區(qū)域(8.5%)，白色區(qū)域表示不允許區(qū)域(0.9%)。The blue region indicates where the amino acid residues are in the favored regions (90.6%),the purple region indicates allowed regions (8.5%),and the white region indicates an outlier regions (0.9%).

2.2 白蛾周氏嚙小蜂OBP1與美國白蛾蛹揮發(fā)物的分子對接

分子對接結(jié)果得到的白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP1與化合物結(jié)合的結(jié)合常數(shù)代表兩者結(jié)合所需的自由能，數(shù)值越小表明結(jié)合特性越強。根據(jù)分子對接結(jié)果共得到了3種可能與CcOBP1結(jié)合特性較強的小分子物質(zhì)(表2),白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP1與γ-丁內(nèi)酯可通過分子間作用力形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)(圖3A-C)，主要通過范德華力和氫鍵進行結(jié)合；CcOBP1的Asn-122、Ala-121與γ-丁內(nèi)酯通過氫鍵結(jié)合；Leu-119、Met-120、Arg-123、Leu-85、Ala-99通過范德華力結(jié)合；Phe-89通過碳磷鍵結(jié)合；Cys-118、Cys-103通過碳碳鍵結(jié)合。

白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP1與鄰苯二甲酸二甲酯主要通過范德華力等作用力進行結(jié)合(圖3D-F)。CcOBP1的Met-68通過磷硫鍵與鄰苯二甲酸二甲酯結(jié)合；Leu-73、Leu-80、Leu-119、Ala-99、Ala-116、Ala-121、Met-67、Asn-122通過范德華力與鄰苯二甲酸二甲酯結(jié)合；Cys-118、Arg-123與鄰苯二甲酸二甲酯通過碳氫鍵結(jié)合；Leu-103、Tyr-64、Met-120、Phe-89與鄰苯二甲酸二甲酯通過碳碳鍵和碳磷鍵結(jié)合。

白蛾周氏嚙小蜂氣味結(jié)合蛋白CcOBP1與萘主要通過范德華力進行結(jié)合(圖3G-I)。CcOBP1的Ala-99、Ala-116、Ala-121、Leu-73、Leu-80、Leu-85、Leu-119、Lsy-88、Asn-122、Arg-123與萘主要通過范德華力進行結(jié)合；Met-67、Met-68、Met-120、Cys-108、Cys-118、Thy-64、Phe-89通過碳碳鍵和碳磷鍵結(jié)合。

表2 可能與白蛾周氏嚙小蜂結(jié)合的化合物及結(jié)合常數(shù)Table 2 Compounds and binding constants that may bind to CcOBP1

3 討論

氣味結(jié)合蛋白(OBPs)和化學感受蛋白(CSP)被認為是昆蟲化學感受中信息素和氣味物質(zhì)的載體。這些蛋白通常位于觸角、口器和其他化學感覺結(jié)構(gòu)中。這兩類蛋白質(zhì)的成員最近已經(jīng)在昆蟲身體的其他部分被檢測到，并且被指出與各種功能有關。在某些情況下，相同的蛋白質(zhì)在觸角和信息素腺中表達，因此在接收和傳播相同的化學信息方面發(fā)揮著雙重作用(Pelosietal.,2017)。在昆蟲觸角特異表達的氣味結(jié)合蛋在很大程度上與昆蟲行為有關。研究發(fā)現(xiàn)，在昆蟲雄性觸角特異表達的氣味結(jié)合蛋白可能與性信息素的結(jié)合有關(鞏中軍等，2005)；在雌性昆蟲觸角特異表達的蛋白可能與尋找寄主和選擇產(chǎn)卵地有關(張婷等，2012；Zhangetal.,2011)。CcOBP1是白蛾周氏嚙小蜂的氣味結(jié)合蛋白，其在雌性白蛾周氏嚙小蜂觸角特異性表達。因此，推測CcOBP1可能會與白蛾周氏嚙小蜂寄主所釋放的揮發(fā)物結(jié)合，因為雌性白蛾周氏嚙小蜂需要尋找合適的寄主產(chǎn)卵，因而需要有較強的感受能力去感知寄主所釋放的揮發(fā)物。

圖3 CcOBP1與小分子化合物對接結(jié)果Fig.3 Result of that docking of CcOBP1 with small molecule compoundsA:CcOBP1與γ-丁內(nèi)酯相互作用的全過程;B:加了表面的CcOBP1與γ-丁內(nèi)酯作用過程;C:CcOBP1與γ-丁內(nèi)酯詳細的作用過程；D:CcOBP1與鄰苯二甲酸二甲酯相互作用的過程;E:加了表面的CcOBP1與鄰苯二甲酸二甲酯的作用過程;F:CcOBP1與鄰苯二甲酸二甲酯作用的詳細過程；G:CcOBP1與萘相互作用的全過程;H:加了表面的CcOBP1與萘的作用過程;I:CcOBP1與萘詳細的作用過程。A:The total appearance of CcOBP1 interacting with γ-butyrolactone; B:The reaction process of CcOBP1 with γ-butyrolactone added at the surface; C:The detailed reaction process between CcOBP1 and γ-butyrolactone; D:The total appearance of CcOBP1 interacting with dimethyl phthalate; E:The reaction process of CcOBP1 with dimethyl phthalate added; F:The detailed reaction process between CcOBP1 and dimethyl phthalate; G:The total appearance of CcOBP1 interacting with naphthalene; H:The reaction process of CcOBP1 with naphthalene added; I:The detailed reaction process between CcOBP1 and naphthalene.

本研究通過Swiss-Model建立了OBP1蛋白的同源模型，然后又與11種小分子物質(zhì)進行了分子對接。對接結(jié)果表明，白蛾周氏嚙小蜂OBP1可能與γ-丁內(nèi)酯、鄰苯二甲酸二甲酯和萘結(jié)合。

本課題組前期對美國白蛾蛹揮發(fā)物中的若干化合物進行了生物活性測定(Zhuetal.,2016)。觸角電位結(jié)果表明，γ-丁內(nèi)酯、鄰苯二甲酸和萘都能引起白蛾周氏嚙小蜂觸角較明顯的電位反應。基于Y型嗅覺儀結(jié)果顯示，γ-丁內(nèi)酯、鄰苯二甲酸二甲酯和萘均對白蛾周氏嚙小蜂具有明顯的趨避作用。γ-丁內(nèi)酯已經(jīng)在其他的研究中被鑒定為植物揮發(fā)物(Moon & Shibamoto,2009；Sellietal.,2008),但γ-丁內(nèi)酯在昆蟲體內(nèi)的作用尚無研究。鄰苯二甲酸二甲酯經(jīng)鑒定為植物揮發(fā)物(丁嘉文等，2015),且其對按蚊等昆蟲具有較好的趨避作用，可以作為蚊蟲的趨避劑(Karunamoorthi & Sabesan,2010；Vatandoosetal.,2008)。萘對赤擬谷盜TriboliumcastaneumHerbst等昆蟲的生長發(fā)育有很大的影響，高濃度的萘可以使其致死(Pajarocastroetal.,2017)，對白蟻等昆蟲具有趨避作用(Aihetashametal.,2017)。

本研究結(jié)果表明，白蛾周氏嚙小蜂CcOBP1與γ-丁內(nèi)酯、鄰苯二甲酸二甲酯和萘的結(jié)合特性較好，CcOBP1的功能可能與白蛾周氏嚙小蜂的趨避效應相關。在白蛾周氏嚙小蜂尋找寄主的過程中，寄主對白蛾周氏嚙小蜂既有引誘作用又有趨避作用，二者是協(xié)同作用的。因此，白蛾周氏嚙小蜂與尋找寄主相關的OBPs的功能既有趨避作用也有趨向作用。本研究結(jié)果表明，CcOBP1的功能為趨避作用，會對美國白蛾蛹中的一些揮發(fā)物產(chǎn)生趨避反應，這也是寄主與寄生性天敵協(xié)同進化的結(jié)果。但這一結(jié)果還需要進一步的驗證，未來將通過熒光競爭結(jié)合實驗進一步證明。