栗洪飛，鄭莉莎，石 巖，王進軍，蔣紅波

西南大學植物保護學院，西南大學農(nóng)業(yè)科學研究院，重慶 400716

橘小實蠅Bactroceradorsalis(Hendel)，又名東方果實蠅，屬雙翅目Diptera實蠅科Tetriphitedae果實蠅屬Bactrocera，是一種重大農(nóng)業(yè)入侵害蟲(陳韶萍等，2014)。橘小實蠅寄主范圍廣，可危害柑橘、番石榴、楊桃、芒果、香蕉、茄子、辣椒、瓜類等46科250多種水果和蔬菜(汪恩國等，2013；袁國瑞等，2016)。由于其極強的環(huán)境適應和入侵擴散能力，已被多個國家列為檢疫對象，并且在熱帶和亞熱帶成為最具毀滅性的害蟲之一(Clarkeetal.，2005)。盡管可以使用寄生蜂等對橘小實蠅進行生物防治，但目前最有效的控制方法仍是化學防治(Linetal.，2012)。近年來，橘小實蠅抗藥性愈演愈烈,如何有效控制其危害，是目前全世界果蔬產(chǎn)業(yè)面臨的一個嚴峻問題。

昆蟲的神經(jīng)肽是一類由昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)分泌的微量高效能小分子蛋白質(zhì)(多肽)，是多細胞生物體內(nèi)的重要信使(魏兆軍和趙遠，2005)。到目前為止，就多細胞生物體而言，昆蟲神經(jīng)肽是最大、種類最多的信號分子(Schoofsetal.，2017)，調(diào)控著昆蟲的許多重要生理過程，如生長、發(fā)育(Guietal.，2017)、取食(Hongetal.，2012；Wangetal.，2013)、記憶(Cervantes-Sandoval & Davis，2012)、生殖(Nilayetal.，2008)、代謝、遺傳(Altstein & N?ssel，2010)等。因此，神經(jīng)肽信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)被認為是理想的防治昆蟲的殺蟲靶標，如tachykinin(Nachmanetal.，2010)、滯育激素(diapaude hormone)(Zhangetal.，2011)、sulfakinin(Yuetal.，2013b)等。研究表明,sulfakinin與昆蟲的取食有極密切的關(guān)系，調(diào)控多種昆蟲的取食行為(Schoofsetal.，2017)。sulfakinins定位于交感神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，類似于哺乳類動物胃分泌素(Andersetal.，2000; Duveetal.，1994；Nichols & Lim，1995)。昆蟲sulfakinins首次于馬德拉蜚蠊LeucophaeamaderaeBrowse頭部的提取物中分離得到(Nachmanetal.，1986)。隨后，又在果蠅(Nicholsetal.，1988)、沙漠蝗SchistocercagregariaForsk (Weietal.，2000)、德國小蠊Blattellagermanica(L.)(Joseetal.，2001)等多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)。研究顯示，注射sulfakinin后的亞洲飛蝗LocustamigratoriaL.減少了食物的攝取(Altstein & N?ssel，2010)，且與sulfakinin的注射量呈正相關(guān)(Zelsetal.，2015)；德國小蠊在注射sulfakinin肽段后，減少了84%的食物攝取(Joseetal.，2001)。與之相反，利用RNAi抑制雙斑蟋Gryllusbimaculatus(De Geer) 、赤擬谷盜TriboliumcastaneumHerbst的sulfakinin，其食物攝取量顯著增加(Meyering-Vos & Müller，2007；Yuetal.，2013a)；RNAi后果蠅出現(xiàn)攝食增加且取食行為異常的現(xiàn)象(S?derbergetal.，2012)；nonsulfated sulfakinin(SK)參與調(diào)節(jié)大麥蟲ZophobasatratusFab的幼蟲和蛹期的糖類和類脂化合物代謝作用，影響其幼蟲脂肪體和線粒體相關(guān)能量代謝活動(Slocinskaetal.，2016)。目前，sulfakinin被定位于許多昆蟲的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且又與昆蟲的取食有密切關(guān)系，意味著其具有重要的生理功能以及良好的藥靶潛力。

sulfakinin表達模式分析可為深入研究橘小實蠅sulfakinin的生理功能、藥靶潛力提供基礎數(shù)據(jù)，為靶向橘小實蠅重要神經(jīng)肽信號傳遞系統(tǒng)、開發(fā)高度特異的控制劑奠定基礎。橘小實蠅sulfakinin具有何種生理功能仍不得而知，是否具有藥靶潛力亟需深入研究。本文以橘小實蠅為對象，克隆獲得了神經(jīng)肽sulfakinin的cDNA全長，并利用實時熒光定量PCR解析了其時空表達模式分析，為進一步研究橘小實蠅sulfakinin基因功能奠定基礎，同時為以昆蟲神經(jīng)肽為靶標的新型殺蟲劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

橘小實蠅于2007年采自云南省(云南品系)，帶回實驗室后飼養(yǎng)于西南大學昆蟲學及害蟲控制工程重點實驗室人工氣候室內(nèi)。飼養(yǎng)溫度(27±1) ℃，飼養(yǎng)相對濕度(70±5)%，光周期14L∶10D。所有試蟲均為人工飼料飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑

高保真DNA聚合酶PrimerSTARTM Max Premix及PCR相關(guān)試劑、半定量PCR所用Taq酶及相關(guān)試劑均購自TakaRa公司，Trizol試劑購自Life Technologies公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司，iQTM SYBR?Green Supermix購自Bio-rad公司。

1.3 樣品的制備

加入Trizol試劑充分研磨，參照Trizol試劑說明書提取樣品的總RNA，瓊脂糖電泳檢測總RNA的完整性，Nanodrop 2000 核酸濃度測定儀檢測其濃度和純度，使用RQ1 Rnase-Free Dnase去除基因組DNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 序列比對分析

在GenBank(XM_011207950)查詢獲得橘小實蠅sulfakinin序列；利用在線程序SignalP 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/Signal P)預測信號肽(signal peptide)；根據(jù)在線程序Neuro Pred(http:∥neuroproteomics.scs.uiuc.edu/neuropred.htm)預測成熟肽切割位點(dibasic cleavage sites)；氨基酸序列比對分析通過DNAMAN、WebLogo等軟件完成。通過MEGA5軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,用在線工具WebLogo (http:∥weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)作圖；利用Primer premier 5.0軟件設計橘小實蠅sulfakinin的特異性qPCR引物(表1)，并用DNAMAN 6.0對所設計的引物進行評價。

表1 研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.5 sulfakinin表達模式分析

橘小實蠅不同發(fā)育階段和不同組織表達模式的樣品收集參照桂順華(2017)方法：不同發(fā)育階段選取卵(1 d)、幼蟲(4 d)、蛹(4 d)、早期成蟲(5 d)、晚期成蟲(10 d)；選取孵化后4日齡幼蟲解剖不同組織，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪體、中腸、馬氏管、氣管和表皮；選取羽化后5日齡未交配的成蟲解剖不同組織，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)、脂肪體、中腸、馬氏管、觸角、精巢和卵巢。每個樣品4個生物重復，總RNA提取和cDNA合成參照1.3。

根據(jù)GenBank查詢獲得的序列設計橘小實蠅sulfakinin特異性qPCR引物，同時采用橘小實蠅α-Tubulin作為內(nèi)參基因(Shenetal.，2010)(GenBank登錄號:GU269902)。qPCR反應體系如下：cDNA 0.5 μL、GoTaq?qPCR Master Mix 5 μL、ddH2O 3.5 μL、上下游引物各0.5 μL。反應條件為95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，進行40個循環(huán)，最后95 ℃后延伸30 s。每次實驗技術(shù)重復2個，生物重復4次。

利用2-△△Ct法(Livak & Schmittgen，2001)對數(shù)據(jù)進行分析。其中，不同發(fā)育階段表達模式研究中，晚期成蟲相對表達量設置為校準值；成蟲不同組織表達模式研究中，成蟲觸角組織的相對表達量設置為校準值；幼蟲不同組織表達模式研究中，幼蟲中腸組織的相對表達量設置為校準值。

1.6 半定量檢測sulfakinin相對表達量

以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，采用巢式PCR擴增，體系為25 μL：cDNA 1 μL、ddH2O17.375 μL、buffer (Mg+) 2.5 μL、dNTP 2 μL、rTaq 0.125 μL、上下游引物各1 μL。反應條件為98 ℃預變性3 min，98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，sulfakinin擴增進行35個循環(huán)，內(nèi)參α-Tubulin擴增進行30個循環(huán)，最后72 ℃后延伸10 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 饑餓脅迫

分別挑取4頭經(jīng)饑餓處理6、12、24 h的橘小實蠅羽化后5日齡的成蟲，加入Trizol充分研磨，總RNA提取和cDNA合成參照1.2，每個處理4個生物重復，每個生物重復雌雄各2頭且只取頭部。

2 結(jié)果與分析

2.1 sulfakinin的序列分析

利用RT-PCR技術(shù)，克隆獲得了橘小實蠅sulfakinin的cDNA全長序列(GenBank登錄號：XM_011207950)。cDNA全長417 bp，編碼138個氨基酸。5′端前30個氨基酸殘基為信號肽序列；前體包含2個成熟肽(圖1)。其成熟肽C端具有典型的sulfakinin基序GHMRFamide(圖2)。

將sulfakinin編碼的氨基酸序列與GenBank登錄的其他昆蟲的sulfakinin氨基酸序列進行比對(表2)，并通過MEGA 5軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，各分支重復檢驗次數(shù)均為1000。結(jié)果表明，橘小實蠅與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的sulfakinin親緣關(guān)系最近，且聚為一支(圖1A)。各目的昆蟲均單獨成一支，與傳統(tǒng)的分類關(guān)系一致，說明昆蟲sulfakinin在進化上具有較好的保守性。

圖1 Sulfakinin的序列分析Fig.1 Sequence analysis of sulfakininA:Sulfakinin系統(tǒng)發(fā)育分析;B:5種不同昆蟲sulfakinin成熟肽序列比對分析。A:Phylogenetic relationships analysis of sulfakinin; B:The alignment of five kinds of insect mature peptides.

圖2 Sulfakinin基因全長序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 The nucleic acid sequence of sulfakinin and the deduced amino acid (AA) sequence*：終止子，成熟肽用下劃線代表。*:Terminator,the underline represents the mature peptide.

表2 不同昆蟲sulfakinin的GenBank登錄信息Table 2 The GenBank ID of sulfakinin of some insects

通過與果蠅、赤擬谷盜、岡比亞按蚊AnophelesgambiaeSay、長紅獵蝽RhodniusprolixusStal五者之間sulfakinin成熟肽序列的比對，發(fā)現(xiàn)橘小實蠅與黑腹果蠅，長紅獵蝽等的sulfakinin都具有較高的保守性(圖1B)。橘小實蠅和果蠅的sulfakinin1序列完全一致，sulfakinin2序列有2個異常的氨基酸殘基，橘小實蠅N端第三、第四位置是2個谷氨酸(E)，而果蠅在對應位置是2個谷氨酰胺(Q)。此外，橘小實蠅、黑腹果蠅與岡比亞按蚊三者的sulfakinin成熟肽都具有完全一致的序列FDDYGHMRFamide。長紅獵蝽sulfakinin1與赤擬谷盜sulfakinin2分別具有一個差異的氨基酸殘基。赤擬谷盜的sulfakinin1 N端第三個位置的苯丙氨酸(F)殘基替換成絲氨酸(S)殘基，長紅獵蝽的sulfakinin2 C端第三個位置的組氨酸(H)殘基被替換為酪氨酸(Y)殘基。

2.2 橘小實蠅sulfakinin的時空表達模式

2.2.1 橘小實蠅不同組織的表達特性 橘小實蠅成蟲的不同組織中，sulfakinin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，約為觸角的2倍,在觸角的相對表達量僅次于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，且顯著高于其他組織(P<0.05)。sulfakinin在脂肪體、中腸、馬氏管、卵巢和精巢中表達量很低或幾乎不表達(圖3)。半定量PCR結(jié)果與之對應。

在橘小實蠅幼蟲的不同組織中，sulfakinin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中顯著高表達(P<0.05)，在脂肪體、中腸及馬氏管中均有一定程度的表達,在表皮和氣管中表達量極低或幾乎不表達(圖4)。其中，sulfakinin在中腸的表達量約等于馬氏管，約為中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達量的1/3；脂肪體中的相對表達量低于中腸和馬氏管，高于表皮；在氣管中的相對表達量最低，幾乎不表達。半定量PCR結(jié)果與之對應。

2.2.2 橘小實蠅不同發(fā)育階段的表達特性 在橘小實蠅的不同發(fā)育階段，sulfakinin在卵期幾乎不表達，在蛹期有一定量的表達，在幼蟲、早期成蟲、晚期成蟲顯著高表達(P<0.05)(圖5)。其中，sulfakinin在早期成蟲中的相對表達量約為晚期成蟲的2倍，幼蟲時期的相對表達量居于早期成蟲與晚期成蟲之間，晚期成蟲的相對表達量在這3個時期最低。半定量PCR結(jié)果與之對應。

圖3 Sulfakinin在橘小實蠅成蟲不同組織的表達模式Fig.3 The expression profiles of sulfakinin in different adult tissues of B.dorsalis柱上不同字母表示經(jīng)LSD多重比較后差異顯著。半定量檢sulfakinin在橘小實蠅成蟲不同組織的相對表達量。FB：脂肪體；MG：中腸；MT：馬氏管；AN：觸角；CNS:中樞神經(jīng)系統(tǒng)；OV:卵巢；TE:精巢。Different letters above the column indicate significant difference at P<0.05.Semi-quantitative RT-PCR detection of sulfakinin levels in different adult tissues of B.dorsalis.FB：Fat body；MG：Midgut；MT：Malpighian tube；AN：Antennae；CNS：Central nervous system；OV：Ovary；TE：Testis.

圖4 sulfakinin在橘小實蠅幼蟲不同組織的表達模式Fig.4 The expression profiles of sulfakinin in different larval tissues of B.dorsalis柱上不同字母表示經(jīng)LSD多重比較后差異顯著。半定量檢測sulfakinin在橘小實蠅幼蟲不同組織的相對表達量。FB：脂肪體；MG：中腸；MT：馬氏管；IN：表皮；CNS：中樞神經(jīng)系統(tǒng)；TR：氣管。Different letters above the column indicate significant difference at P<0.05.Semi-quantitative RT-PCR detection of sulfakinin levels in different larval tissues of B.dorsalis；FB：Fat body；MG：Midgut；MT：Malpighian tube；IN：Skin；CNS：Central nervous system；TR：Tracheal.

圖5 Sulfakinin在橘小實蠅不同發(fā)育階段的表達模式Fig.5 The expression profiles of sulfakinin in different developmental stages of B.dorsalis柱上不同字母表示經(jīng)LSD多重比較后差異顯著。半定量檢測sulfakinin在橘小實蠅成蟲不同組織的相對表達量。Different letters above the column indicate significant difference at P<0.05.Semi-quantitative RT-PCR detection of sulfakinin levels in different developmental stages of B.dorsalis.

2.3 sulfakinin在饑餓脅迫下的表達模式

橘小實蠅成蟲在饑餓脅迫下，sulfakinin表達量隨時間發(fā)生變化。結(jié)果顯示，橘小實蠅成蟲饑餓6 h后，sulfakinin的相對表達量為0.31，低于對照的0.58；隨著饑餓時間不斷延長，sulfakinin的表達量呈下降趨勢；饑餓12 h后，sulfakinin的表達量達0.18，低于對照的0.26；24 h后，sulfakinin表達量為0.20，低于對照的0.27；總體來看，饑餓處理后成蟲sulfakinin相對表達量均低于對照組，其中，饑餓6 h處，sulfakinin的表達量下降幅度最大。

3 討論

本研究通過與其他昆蟲sulfakinin編碼氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅、擬果蠅、赤擬谷盜等昆蟲的sulfakinin單獨聚為一簇；通過與其他昆蟲的sulfakinin成熟肽序列的比對發(fā)現(xiàn)，橘小實蠅與黑腹果蠅、赤擬谷盜、岡比亞按蚊、長紅獵蝽等的sulfakinin1和sulfakinin2均相似度很高，這表明物種之間的sulfakinin均有很好的保守性。

大量研究證實，sulfakinin調(diào)控昆蟲對食物的攝取，這與本研究中sulfakinin在橘小實蠅不同發(fā)育時期表達模式結(jié)果一致，sulfakinin在幼蟲、成蟲期等取食高峰期抑制試蟲過量取食而高表達，而在卵期和蛹期無取食行為時期則幾乎不表達。

本研究發(fā)現(xiàn)，sulfakinin在橘小實蠅成蟲和幼蟲氣管中高表達，而在幼蟲和成蟲的其他組織表達量很低或幾乎不表達，這與在反吐麗蠅CalliphoravomitoriaL.(Duveetal.，1994)、美洲大蠊Periplanetaamericana(L.)(Eastetal.，1997)及黑腹果蠅(Nichols & Lim，1995)中的研究結(jié)果相似。研究還發(fā)現(xiàn)，sulfakinin在橘小實蠅成蟲的觸角中也顯著性高表達。由于觸角是昆蟲感覺系統(tǒng)的重要組成部分，行使嗅覺,感受氣流、CO2、濕度和溫度等功能，左右其選擇食物、取食、躲避危險等一系列行為。這暗示橘小實蠅sulfakinin在外周神經(jīng)系統(tǒng)也扮演著重要角色，極有可能與嗅覺相關(guān)。

Sulfakinin在橘小實蠅早期成蟲中的表達量約為晚期成蟲的2倍。羽化不久的早期成蟲需要補充營養(yǎng)以達到性成熟，尤其在鱗翅目和雙翅目昆蟲的生殖活動起重要作用。因此，早期成蟲比晚期成蟲的sulfakinin表達量的差異極大可能與此有關(guān)。

Sulfakinin在橘小實蠅幼蟲脂肪體有一定程度的表達，其是否承擔脂肪體和線粒體的相關(guān)能量代謝還有待進一步研究。另有研究表明，雙斑蟋腸道有sulfakinin基因的表達(Meyering-Vos & Müller，2007),然而，sulfakinin在橘小實蠅中腸沒有顯著性表達，這暗示sulfakinin在橘小實蠅與雙斑蟋之間可能承擔著截然不同的生理功能。

研究表明，sulfakinin是類似于哺乳類動物胃分泌素或腸促胰酶肽，有減少食物消耗的作用(Joseetal.，2001; Nachmanetal.，1986)。本研究結(jié)果顯示，橘小實蠅成蟲在饑餓過程中，sulfakinin表達量起初下降幅度最大，隨時間推移，下降幅度減小，但仍低于對照組,暗示sulfakinin參與了饑餓調(diào)節(jié)過程。究竟其如何調(diào)節(jié)橘小實蠅對饑餓的響應過程仍需進一步研究。