李 楠，遲少麗，劉 巖，王連友

目前肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是人類最常見的惡性腫瘤之一，且其發(fā)病率和病死率呈逐漸上升趨勢［1，2］。肺腺癌診斷及預(yù)后方面的研究對臨床治療有重要意義。目前研究認(rèn)為LUAD的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段以及多基因共同改變作用的結(jié)果，其中長鏈非編碼RNA（lncRNA）被認(rèn)為發(fā)揮了重要作用［3］。lncRNA是一類長度大于200 nt的RNA分子，不編碼蛋白質(zhì)，可以在不同水平調(diào)控基因的表達(dá)，包括染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)，與人類多種疾病尤其是腫瘤密切相關(guān)［4－6］，目前已有研究發(fā)現(xiàn)，某些 lncRNA 在胰腺癌、直腸癌及肝細(xì)胞癌中表達(dá)明顯升高［7－9］，提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但目前關(guān)于lncRNA在肺腺癌中作為腫瘤標(biāo)志物的研究較少。為此，該次研究擬通過對TCGA （The Cancer Genome Atlas）公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)挖掘，探索其在LUAD中差異表達(dá)的lncRNAs作為LUAD腫瘤標(biāo)志物的效果及指導(dǎo)判斷預(yù)后的意臨床義。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 高通量RNA－seq結(jié)果于2017年8月2日從TCGA數(shù)據(jù)庫利用Bioconductor/TCGA biolink從TCGA數(shù)據(jù)庫下載。利用Kaplan－Meier Plotter數(shù)據(jù)（http：//kmplot.com/analysis/）中的肺腺癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析。先在LUAD樣本中篩選高突變頻率的lncRNAs。該研究在 HGNC（www.genenames.org）數(shù)據(jù)庫中搜集了265個經(jīng)證實(shí)的lncRNAs，將獲得的lncRNAs名稱全部導(dǎo)入cBioPortal數(shù)據(jù)庫（http：//www.cbioportal.org），在基因組和轉(zhuǎn)錄組層面進(jìn)行變異分析，RNA表達(dá)差異Z－score閾值為±2，在所有病例中改變超過10%的lncRNAs被認(rèn)為有顯著性差異。再驗證具有顯著性差異的lncRNAs在腫瘤和正常組織中的表達(dá)差異。所有篩選出具有明顯變異的lncRNAs均使用oncomine數(shù)據(jù)庫（www.oncomine.org）在 LUAD和正常組織中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異驗證。若Fold change（FC）＞1.5且P值＜0.05則認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 統(tǒng)計學(xué)分析 使用Graphpad prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析， 包括 t－test、heatmap、ROC 分析。生存分析采用Kaplan-Meier和log-rank檢驗法。P＜0.05則認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌中變異明顯的lncRNAs 所有備選的lncRNAs均為出現(xiàn)突變的，但是，在265個lncRNA中有8個lncRNA的拷貝數(shù)和表達(dá)量的總變異率超過 10%（圖 1）。 分別為 CASC8 （10%）、HCG11（10% ）、DGCR5 （11% ）、TP53TG1 （14% ）、PVT1（21% ）、PTCSC3（13%）、HAR1A （13%）及 HAR1B（10%）。

圖1 基因拷貝數(shù)和mRNA差異熱圖

2.2 總變異率超過10%的lncRNA對肺腺癌診斷及預(yù)后價值的相關(guān)性 利用Kaplan－Meier Plotter在線數(shù)據(jù)對上述得到的8個lncRNA進(jìn)行生存分析， 結(jié)果得出，PVT1、HCG11、TP53TG1 和 DGCR5高表達(dá)患者的預(yù)后低于低表達(dá)患者，且結(jié)果具有顯著性差異 （P＜0.05， 圖2）。 以上結(jié)果顯示，PVT1、HCG11、TP53TG1和DGCR5是 LUAD預(yù)后不良因素，四者的高表達(dá)與患者生存期縮短呈顯著性相關(guān)（P＜0.05）。利用Oncomine中的肺腺癌組織和正常肺組織的RNA－seq數(shù)據(jù)對上述 4個 lncRNA進(jìn)行ROC分析，TP53TG1和HCG11結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；PVT1 和 DGCR5 AUC 分別為 0.975 （P＜0.01），0.9722（P＜0.01），說明具有良好診斷效率（圖3）。綜合上述結(jié)果，PVT1和DGCR5可能成為判斷肺腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。

圖2 總變異率超過10%的8個lncRNAs生存分析

圖3 4個lncRNAs ROC分析

2.3 4個lncRNAs在腫瘤和正常組織中表達(dá)差異驗證 利用Oncomine數(shù)據(jù)庫的TCGA肺腺癌和正常 組 織 中 PVT1、HCG11、TP53TG1 和 DGCR5 的RNA－seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，驗證其差異表達(dá)。結(jié)果顯示，PVT1在LUAD組織中比正常肺癌組織升高了2.232 倍 （P＜0.01），TP53TG1 升高 1.467 （P=0.021）倍，DGCR5 升高了 1.702 倍 （P=2.24E－12）。 而HCG11沒有顯著性差異。筆者所在課題組將P＜0.01的作為有極顯著性差異。上述結(jié)果顯示，PVT1和DGCR5在LUAD組織中的表達(dá)量明顯高于正常肺癌組織，且差異具有極顯著性（P＜0.01）。見圖4。

圖4 PVT1、TP53TG1、HCG11 和 DGCR5 在正常肺組織和LUAD組織中的表達(dá)驗證

2.4 PVT 1和DGCR5在其他類型腫瘤組織中的表達(dá)分析 利用Oncimne數(shù)據(jù)庫對PVT1和DGCR5在29種腫瘤和正常組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，PVT1 在結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma，COAD）、肝臟肝細(xì)胞癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）、LUAD、肺鱗狀細(xì)胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）、 胰 腺 癌 （pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、直腸腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）、胃腺癌 （stomach adenocarcinoma，STAD）、胸腺瘤（thymoma，THYM）中明顯升高，在 LAML，OV，THCA中明顯下降。而DECR5僅在LUAD明顯上升，在LGG、PAAD和TGCT中明顯下降。結(jié)果顯示作為LUAD的標(biāo)志物，DGCR5更具有特異性。

3 討論

LUAD是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療可以大大提高肺腺癌患者的存活率［10］。目前臨床常規(guī)物理診斷很難發(fā)現(xiàn)＜1 cm的腫瘤，而傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物的靈敏度和特異性也不夠高［11］。因此，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，尋找理想的腫瘤標(biāo)志物對于提高惡性腫瘤診治水平具有重大意義。近年來研究發(fā)現(xiàn)lncRNA具有多種生物活性，參與了X染色體沉默、染色體修飾、轉(zhuǎn)錄激活與抑制及RNA剪切等過程，在細(xì)胞分化、胚胎與組織發(fā)育、腫瘤中均發(fā)揮重要功能［12－14］，但 lncRNA 的數(shù)量眾多，生物學(xué)功能尚不完全清楚。 Han等［15］發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，lncRNA GAS6－AS1（growth arrest specific gene6 antisense，RNA1）在 NSCLC組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)。且GAS6－AS1的水平與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及預(yù)后密切相關(guān)，GAS6－AS1表達(dá)水平越低，患者生存期越短。 Zhang 等［16］通過 qRT－PCR 技術(shù)，分析 62組肺腺癌組織和鄰近的癌旁組織ZXF1表達(dá)的差別，發(fā)現(xiàn)與鄰近的正常組織相比，肺腺癌組織中ZXF1水平顯著增高；進(jìn)一步分析ZXF1與患者的臨床病理學(xué)特征、預(yù)后之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ZXF1表達(dá)上調(diào)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、腫瘤的病理分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的范圍有關(guān)。這說明，長鏈非編碼RNA在肺腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且在腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲中發(fā)揮重要作用。

lncRNA在肺癌的發(fā)生、發(fā)展和耐藥過程中有重要的調(diào)控作用，這些lncRNA部分發(fā)揮致癌作用，因此，加深加快對lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的機(jī)制研究有助于對肺癌的早期診斷及預(yù)后判斷。在該次研究中，利用TCGA數(shù)據(jù)庫對肺腺癌中l(wèi)ncRNA進(jìn)行挖掘，發(fā)現(xiàn)8個在基因拷貝數(shù)和表達(dá)差異超過10%的lncRNA，并利用在線數(shù)據(jù)分析其在肺腺癌診斷和預(yù)后判斷中的臨床價值，找到了PVT1和DRCG5兩個較大臨床價值的lncRNA，通過兩種分子在LUAD表達(dá)的驗證和其他腫瘤類型中表達(dá)分析，確定DGCR5可以作為特異的對LUAD進(jìn)行診斷和判斷預(yù)后的指標(biāo)，為臨床腫瘤標(biāo)記物的篩選建立提供了研究依據(jù)。