余成鵬，胡蓉花，陳小強(qiáng),蘇 穎，林培炯，劉瓊光*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.江西省吉安市煙草公司，江西 吉安 343000)

茄科勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum，俗稱青枯菌)是世界性重要植物病原細(xì)菌，廣泛分布于熱帶、亞熱帶以及部分溫帶地區(qū)，能侵染 54 個(gè)科450 余種植物[1-2]。青枯菌是一個(gè)多變的復(fù)合種(species complex)，其寄主范圍、地理分布、致病性以及生理特性具有多樣性和復(fù)雜性[1,3]，因此，對(duì)其種下分類研究較多，包括傳統(tǒng)的生理小種(race)和生化變種等(biovar)[4-5]。Fegan[6]和Prior[7]提出以演化型分類框架來描述青枯菌種以下的差異。

中國(guó)青枯菌具有豐富的遺傳多樣性，存在著演化型I型中的10個(gè)序列變種，以及演化型II型中的1個(gè)序列變種、其中演化型I型菌種為中國(guó)的優(yōu)勢(shì)菌系。迄今為止，在中國(guó)尚未發(fā)現(xiàn)演化型III型和演化型IV菌株[8]。

由青枯菌引起的煙草青枯病是我國(guó)煙草種植區(qū)嚴(yán)重的病害之一，目前尚未有理想的化學(xué)防治藥劑。噬菌體(bacteriophage，phage)，是一種感染細(xì)菌的病毒，廣泛存在于自然界，數(shù)目龐大[9]，且具有?；院吞禺愋缘忍攸c(diǎn)，探討利用噬菌體來防治植物病害引起了研究者的廣泛興趣[10]。利用噬菌體對(duì)煙草青枯病進(jìn)行防治，發(fā)現(xiàn)能有效降低煙草青枯病的發(fā)病率[11]，顯示噬菌體防治作物青枯病的良好前景。然而，實(shí)際應(yīng)用中，還受到噬菌體寄主范圍的限制。

盡管我國(guó)各地?zé)煵萸嗫菥饕獙儆?號(hào)小種，生化變種III(生化型III)[12-19]，然而，對(duì)這些菌株的進(jìn)一步聚類分析較少，而且，目前尚未有利用噬菌體對(duì)青枯菌進(jìn)行遺傳分類。本論文目的是測(cè)定6個(gè)不同噬菌體對(duì)來自廣東和江西的煙草青枯菌的侵染，并基于青枯菌對(duì)噬菌體的敏感性試驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)煙草青枯菌進(jìn)行聚類分析，明確6個(gè)噬菌體的寄主范圍，及煙草青枯菌的聚類分組，其結(jié)果將有助于揭示噬菌體與青枯菌之間的關(guān)系，為生產(chǎn)上煙草青枯菌的流行監(jiān)測(cè)，青枯病的防治等提供重要的信息和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試培養(yǎng)基

1.1.1 普通細(xì)菌培養(yǎng)基 牛肉膏3 g，酵母菌3 g，蛋白胨3 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸氫二鉀2 g，硫酸二氫鉀0.5 g，蔗糖15 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.2 半固體培養(yǎng)基 牛肉膏3 g，酵母菌3 g，蛋白胨3 g，硫酸鎂0.25 g，硫酸氫二鉀2 g，硫酸二氫鉀0.5 g，蔗糖15 g，瓊脂8 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 LB液體培養(yǎng)基 胰蛋白胨(tryptone)10 g，酵母提取物(yeast extract)5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水1 000 mL，pH=7.4。

1.1.4 TTC培養(yǎng)基 水解干酪素1 g，蛋白胨10 g，甘油5 mL，瓊脂32 g，1%三苯基四氮唑(TTC)10 mL，蒸餾水1 000 mL。

1.2 供試菌株及其來源

供試的75個(gè)煙草青枯菌菌株分別來自江西省吉安、贛州和撫州，廣東省梅州和韶關(guān)等，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室保存和提供(表1)。

1.3 供試噬菌體

供試6個(gè)煙草青枯菌噬菌體分離自江西省和廣東省煙田土壤，分別為P1521、P1553、P1556-1、P1556-2、P574-2和P7-1，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)菌研究室保存和提供。

1.4 煙草青枯菌培養(yǎng)

供試煙草青枯菌以及供試噬菌體的宿主煙草青枯菌先用固體培養(yǎng)基平板活化，取單菌落接種于10 mL的LB液體培養(yǎng)基中，于30 ℃，180 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

1.5 噬菌體增殖培養(yǎng)

取1 mL供試噬菌體和1 mL其宿主菌于10 mL的LB液體培養(yǎng)菌中，于30 ℃ 180 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)24 h。

1.6 噬菌體侵染試驗(yàn)

采用雙層平板檢測(cè)法，具體步驟為：取1 mL供試煙草青枯菌菌液加入150 mL冷卻至45 ℃的半固體培養(yǎng)基中，混勻后快速倒入含有普通細(xì)菌培養(yǎng)基的平板上，每個(gè)平板約12 mL，制成雙層平板，待平板冷卻凝固后，取3 μL供試噬菌體液點(diǎn)接在上述平板表面，30 ℃培養(yǎng)2 d，觀察并記錄平板上產(chǎn)生噬菌斑情況。

表1 75個(gè)煙草青枯菌菌株編號(hào)和地理來源

1.7 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)雙層平板上噬菌斑的有無，記錄每個(gè)供試青枯菌對(duì)6個(gè)噬菌體的敏感情況，有噬菌斑記為“1”，無噬菌斑記為“0”，制成Excel表格用于聚類分析。

采用PASW Statistics 18 軟件，對(duì)結(jié)果組間連接方法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，繪制出聚類樹狀圖，進(jìn)行利用噬菌體分析煙草青枯菌的遺傳多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體侵染青枯菌平板檢測(cè)

指示菌為青枯菌NXWJYTC2菌株Indicative strain was NXWJYTC2圖1 雙層平板培養(yǎng)檢測(cè)噬菌斑Fig.1 The detection of phage by double plate plaque assay

通過雙層平板檢測(cè)法，測(cè)定了6個(gè)噬菌體P1521、P1553、P1556-1、P1556-2、P574-2和P7-1對(duì)75個(gè)煙草青枯菌的侵染和裂解作用，如果某個(gè)青枯菌指示菌株的平板上產(chǎn)生噬菌斑，說明該噬菌體侵染并裂解該青枯菌(圖1)，反之，如無噬菌斑出現(xiàn)，說明噬菌體不侵染該青枯菌。

2.2 6個(gè)噬菌體的寄主范圍及噬菌體分組

6個(gè)噬菌體對(duì)75個(gè)青枯菌的裂解情況見表2。從表2中看出，有17個(gè)青枯菌菌株都能被6個(gè)噬菌體裂解，而6個(gè)噬菌體都不能裂解青枯菌Tb15菌株。不同噬菌體裂解75個(gè)青枯菌存在差異。噬菌體P1556-1能侵染65個(gè)青枯菌菌株，其中包括了78.26%的廣東菌株和90.38%的江西菌株，占供試青枯菌的86.7%，噬菌體P1521，能侵染63個(gè)青枯菌菌株，噬菌體P1553侵染的青枯菌最少，只能侵染其中的24個(gè)菌株，其中廣東菌株占52.17%，江西菌株占23.08%。不同噬菌體侵染的青枯菌數(shù)量存在差異(表3)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，如果以侵染90%以上的菌株為衡量標(biāo)準(zhǔn)，那么在江西贛州煙區(qū)可使用P1556-1和P1521噬菌體，江西吉安煙區(qū)可使用P1556-1和P7-1噬菌體，撫州煙區(qū)可用P1521和P574-2，廣東韶關(guān)煙區(qū)適宜使用P574-2噬菌體，而噬菌體P1553寄主范圍較窄，不適宜在廣東和江西兩省煙區(qū)使用。

表2 6個(gè)噬菌體對(duì)75個(gè)青枯菌的裂解情況

“+”：有噬菌斑；“-”：無噬菌斑

“+”,with plaque,“-”:no plaque

表3 6個(gè)噬菌體可侵染的煙草青枯菌數(shù)量及其所占比例

根據(jù)6個(gè)噬菌體對(duì)75個(gè)青枯菌的侵染情況，可將6個(gè)噬菌體分為3組，其中P1556-1，P1556-2和P7-1為P-I組，P-II組包括P1521和P574-2，P1553為P-III組(圖2)。

2.3 基于噬菌體對(duì)75個(gè)煙草青枯菌的聚類分析

圖2 基于對(duì)75個(gè)青枯菌侵染而進(jìn)行的噬菌體分組Fig.2 Phage types based on the infection to 75 strains of Ralstonia solanacearum

從上述寄主范圍較廣、寄主范圍中等和寄主范圍較窄的3組噬菌體中，各選擇1個(gè)噬菌體，如P1556-1、P574-2 和P1553，對(duì)75個(gè)青枯菌進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，75個(gè)青枯菌可分為7個(gè)遺傳組(Rs-I～Rs-VII)(表2、表4和圖3)，其中Rs-IV菌株數(shù)量較多，包括31個(gè)青枯菌，占供試菌株的41.33%，這些菌株對(duì)P1553噬菌體均不敏感，而對(duì)P1556-1和P574-2 2個(gè)噬菌體敏感，其次為Rs-VII遺傳組，共有18個(gè)菌株，它們均對(duì)3個(gè)噬菌體敏感，Rs-I 只有2個(gè)菌株，各來自江西峽江和廣東蕉嶺，它們對(duì)這3個(gè)噬菌體均不敏感，Rs-II 共有13個(gè)菌株，它們表現(xiàn)為對(duì)噬菌體P1556-1敏感，而對(duì)P574-2 和P15533不敏感。Rs-III有5個(gè)菌株，表現(xiàn)為對(duì)噬菌體P574-2敏感，對(duì)P1556-1和P15533不敏感。Rs-V共有3個(gè)菌株，它們對(duì)P1556-1不敏感，而對(duì)噬菌體P574-2 和P15533敏感。而在Rs-VI中的3個(gè)青枯菌中，均表現(xiàn)為對(duì)P1556-1和P15533敏感，對(duì)噬菌體P574-2不敏感。說明，75個(gè)煙草青枯菌之間存在較多的異質(zhì)性和遺傳差異。

進(jìn)一步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自江西和廣東兩省煙區(qū)的青枯菌存在差異(表5)，其中Rs-IV遺傳組在各煙區(qū)所占比例均較大，分別來自廣東省4個(gè)縣和江西省9個(gè)縣的煙區(qū)，其中，在江西省吉安和贛州煙區(qū)所占比例最大，撫州市(樂安、宜黃和崇仁)煙區(qū)5個(gè)菌株只分布在Rs-IV和Rs-III遺傳組。在廣東省二大煙區(qū)中，其青枯菌除了在Rs-VI中沒有分布之外，其它遺傳組中青枯菌也是零星分布，韶關(guān)煙區(qū)不含有Rs-I遺傳組，梅州煙區(qū)不含有Rs-III遺傳組。Rs-V遺傳組全部來自廣東省煙區(qū)，沒有江西煙區(qū)菌株，而Rs-VI遺傳組則不含有廣東煙區(qū)菌株，說明，江西和廣東兩省煙草青枯菌存在差異(表5)。

表4 基于噬菌體P1556-1、P574-2和P1553對(duì)75個(gè)青枯菌的分型結(jié)果

圖3 基于噬菌體P1556-1，P574-2和P1553對(duì)75個(gè)青枯菌聚類Fig.3 The clustering analys of 75 Ralstonia solanacearum strains based on phage P1556-1,P574-2 and P1553

遺傳組Genetic groups江西省煙區(qū)青枯菌菌株數(shù)/個(gè)Number of R. solanacearumin Jiangxi Province吉安Ji’an贛州Guangzhou撫州Fuzhou廣東省煙區(qū)青枯菌菌株數(shù)/個(gè)Number of R. solanacearum in Guangdong Province韶關(guān)Shaoguan梅州Meizhou總數(shù)/個(gè)TotalRs-I100012Rs-II9101213Rs-III112105Rs-IV16635131Rs-V000123Rs-VI120003Rs-VII5407218總數(shù)Total3314515875

3 討論與結(jié)論

隨著噬菌體分離技術(shù)的提高以及噬菌體治療技術(shù)在人類疾病上的成功應(yīng)用，近年來，作物上利用噬菌體進(jìn)行細(xì)菌性病害防治也有了跨越式的發(fā)展[20]，如利用噬菌體防治辣椒和番茄葉斑病(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria.)[21]和梨火疫病(Erwiniaamylovora)等[22]。在青枯病菌噬菌體研究方面，從青枯菌篩選到的2個(gè)噬菌體菌株，能降低煙草青枯病的發(fā)病率[11]。裂解譜較廣的噬菌體M-DS1可以用來檢測(cè)土壤青枯菌的存在，其檢測(cè)靈敏度達(dá)102cfu/g[23]。國(guó)外有研究報(bào)道利用噬菌體防治作物青枯病，并完成了有關(guān)噬菌體的基因組序列分析[24-26]，這為噬菌體基因庫(kù)增添了新的資料，盡管如此，但至今噬菌體制劑產(chǎn)品的應(yīng)用仍然極少。盡管利用噬菌體防治作物青枯病顯示了良好的應(yīng)用前景，但是，依靠噬菌體進(jìn)行青枯病防治依然存在一些問題，如噬菌體侵染的寄主范圍有限，青枯菌的遺傳多樣性豐富。

本研究測(cè)定了6個(gè)青枯菌噬菌體對(duì)75個(gè)煙草青枯菌侵染試驗(yàn)，結(jié)果表明，噬菌體P1556-1、P1521和 P7-1寄主范圍較廣，能侵染其中80%以上的青枯菌，噬菌體P1553寄主范圍較窄，為此，在利用噬菌體防治青枯病的實(shí)際應(yīng)用中，要考慮噬菌體的寄主范圍。據(jù)此，筆者認(rèn)為，在江西贛州煙區(qū)適宜使用P1556-1和P1521噬菌體，江西吉安煙區(qū)可使用P1556-1和P7-1噬菌體，撫州煙區(qū)可用P1521和P574-2，而廣東韶關(guān)煙區(qū)適宜使用P574-2噬菌體，噬菌體P1553寄主范圍較窄，不適宜在廣東和江西兩省煙區(qū)使用。然而，6個(gè)噬菌體的田間應(yīng)用及防治效果，還需要進(jìn)一步的田間防治試驗(yàn)。

青枯菌具有高度的變異性和適應(yīng)性，不同地域之間以及不同寄主的菌株間有明顯的變異以及分化現(xiàn)象[7]，所以目前針對(duì)青枯菌的遺傳多樣性的研究有很多文獻(xiàn)報(bào)道。然而，基于噬菌體對(duì)青枯菌的聚類分析鮮見報(bào)道。本論文選取了廣東和江西省20個(gè)縣市的75個(gè)煙草青枯菌菌株，測(cè)定了它們對(duì)3個(gè)代表性的青枯菌噬菌體的敏感性，結(jié)果表明，75個(gè)青枯菌可分為7個(gè)遺傳組(Rs-I～Rs-VII)。聚類結(jié)果表明，Rs-IV遺傳組菌株數(shù)量較多，包括31個(gè)青枯菌，占供試菌株的41.33%，是江西和廣東省煙區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌株，這些菌株對(duì)P1553噬菌體均不敏感，但卻能被噬菌體P1556-1和P574-2裂解。其次為Rs-VII遺傳組，共有18個(gè)菌株，它們均能被P1556-1、P574-2和 P1553等噬菌體裂解，而來自江西峽江的Tb2014-3-2和廣東蕉嶺的Tb15菌株對(duì)P1556-1、P574-2和 P1553 3個(gè)噬菌體均不敏感。進(jìn)一步分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自江西和廣東兩省五大煙區(qū)的青枯菌也存在差異，Rs-IV遺傳組在江西省吉安和贛州煙區(qū)所占比例最大，撫州煙區(qū)5個(gè)菌株只分布在Rs-IV和Rs-III遺傳組。在廣東省二大煙區(qū)中，其青枯菌除了在Rs-VI中沒有分布之外，其它遺傳組中青枯菌也是零星分布，韶關(guān)煙區(qū)不含有Rs-I遺傳組，梅州煙區(qū)不含有Rs-III遺傳組。Rs-V遺傳組只含有廣東省煙區(qū)菌株，而Rs-VI遺傳組則不含有廣東煙區(qū)菌株，基于噬菌體對(duì)青枯菌聚類分析的結(jié)果，表明，部分遺傳組與青枯菌的地理來源存在一定的相關(guān)性。我國(guó)廣東[16]，福建[13]，貴州[15]，江西[18]，湖北[14]，河南[19]等煙區(qū)，先后進(jìn)行了煙草青枯菌菌系分化研究，主要屬于1號(hào)小種，生化變種III，但還不能從根本上反映廣東和江西兩省煙草青枯菌菌株之間的差異，因?yàn)樗鼈兌紝儆?號(hào)小種和生化型III，本研究基于噬菌體方面反映了江西和廣東兩省煙草青枯菌的菌系的差異，進(jìn)一步豐富了前人的研究結(jié)果。