賈少丹,李靖,劉偉,紀霞

(山東青島市市立醫(yī)院干部保健科，青島 266071)

Apelin 是一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，是由同一基因編碼的具有不同分子結構的一組內源性活性肽，它是血管緊張素Ⅱ1 型受體相關蛋白(APJ)的內源性配體，該類肽通過作用于APJ參與胰島素敏感性、心血管功能、氧化應激及炎癥等病理生理過程，與糖尿病多種微血管并發(fā)癥關系密切。本研究應用四引物擴增受阻突變體系聚合酶鏈反應(ARMS-PCR)技術，測定2型糖尿病患者Apelin基因rs2235306位點多態(tài)性，探討Apelin在糖尿病腎病發(fā)病機制中的作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 選擇2016年6月至2017年5月在我院門診就診和住院的2型糖尿病患者121例為研究組，診斷符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標準，并根據(jù)尿清蛋白與肌酐(UACR)的比值是否≥30 mg/gCr，分為正常蛋白尿組(NA組:UACR<30 mg/gCr)和微量清蛋白尿組(MA組:UACR 30～300 mg/gCr)。其中NA組58例，男27例，女31例；年齡范圍28～65歲，年齡(48.3±14.7)歲；MA組63例，男30例，女33例，年齡范圍29～62歲，年齡(46.6±11.5)歲。選擇同期健康體檢者60例為健康對照組，男28例，女32例；年齡范圍27～62歲，年齡(47.2±13.7)歲。并經葡萄糖耐量試驗排除糖尿病。

所有研究對象肝功能、尿素氮和血肌酐均正常，排除尿路感染和其他腎臟疾病患者。所有參加本研究者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般臨床指標和生化指標檢測 所有研究對象由專人測量身高、體質量、腰圍、血壓，計算體質指數(shù)(BMI)。各受試者于采血前夜22:00 后禁食,次晨抽取肘靜脈血5 mL，其中3 mL送檢生化指標如空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FIns)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)及；余2 mL在-80 ℃冰箱保存，用于DNA提取和酶聯(lián)免疫吸附法檢測Apelin水平。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(FPG×FIns)/22.5。

1.2.2 基因組DNA提取 應用美國Promega公司DNA提取試劑盒，嚴格按照試劑盒操作說明提取全血基因組DNA，提取后的DNA應用微量核酸蛋白測定儀(NanoVue超微量分光光度計，英國)進行定性、定量分析，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物合成 根據(jù)Genebank中提供的基因組序列由上海生工生物技術有限公司設計T-ARMS-PCR引物，其中(1)內引物-上游引物5′-CCCCCTGCACCATCTGCTT-3′，下游引物5′-GGGACAGGGATCTAGTAGCAGGAAG-3′；(2)外引物-上游引物5′-AAGTGGTGCAGGGTATCCTTGGGT-3′，下游引物5′-AAGGAGCCAAGGAGGAAC AGAGC-3′。

1.2.4 DNA擴增條件 PCR反應體系總體積25 μL，包括模板DNA 100 ng，四引物各1 μL(10 mmol/L)，10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 0.5 μL(10 mmol/L)，MgCl21.5μL(25 mmol/L)，TaqDNA 聚合酶為0.15 μL(5 u/μL)，加雙蒸水至25 μL。所有試劑均由Fermentas公司提供。PCR反應條件：①95 ℃預變性5 min，②95 ℃變性30 s，③61 ℃退火30 s，④72 ℃延伸60 s，進行35個循環(huán)，最后72 ℃終末延伸10 min。

1.2.5 擴增產物驗證 應用2%瓊脂糖制膠，取擴增產物10 μL進行凝膠電泳，EB染色，以DL-600DNA片段長度為參考標準，使用培清JS-780A 全自動凝膠成像分析儀觀察電泳結果并拍照保存。

2 結果

2.1 Apelin基因rs2235306位點多態(tài)性結果 PCR產物電泳后于208 bp和458 bp處出現(xiàn)兩條帶者為野生純合型TT；于295 bp和458 bp處出現(xiàn)兩條帶者為突變純合型CC；于208 bp、295 bp和458 bp處出現(xiàn)三條帶者為突變雜合型TC。見圖1。

2.2 三組研究對象Apelin基因rs2235306位點多態(tài)性比較 三組研究對象Apelin基因rs2235306位點的基因型和等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)。MA組CC基因型頻率及C等位基因頻率明顯高于NC組(χ2值分別為4.591、4.082，P值為0.032、0.043)；與NA組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。NA組CC基因型頻率及C等位基因頻率與NC組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

注：M為DL-600maker；1、2、5為CC基因型；3為TT基因型；4、6為TC基因型

圖1Apelin基因rs2235306位點多態(tài)性

2.3 糖尿病組Apelin基因rs2235306位點多態(tài)性與其他臨床指標的關系 由于人群CC型基因分布頻率少，因此采用TC+CC與TT比較。糖尿病組TC+CC基因型與TT基因型比較，F(xiàn)Ins、HOMA-IR和Apelin水平明顯升高(均P<0.05)。見表2。

2.4 Apelin的影響因素分析 以Apelin為因變量，年齡、腰圍(WC)、BMI、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、TC、TG、HDL-C、LDL-C、FPG、FIns、HOMA-IR為自變量的多元逐步回歸分析顯示Apelin與HOMA-IR和BMI正相關(t=4.078、2.071,均P<0.05),因此，HOMA-IR和BMI是Apelin的獨立相關因素(r2分別為0.148和0.171，均P<0.05)。見表3。

表3 Apelin與其他指標的多元逐步回歸分析

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，起病隱匿，以微量清蛋白尿為早期表現(xiàn)，其確切的發(fā)病機制目前尚未完全闡明。許多研究顯示細胞因子和炎性反應參與了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展[1-2]。Apelin是1998年被發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，與血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)同源，具有降血壓、增強心肌收縮力、促進胰島素分泌及垂體激素的釋放等多種生物學效應[3-5]。研究發(fā)現(xiàn)Apelin不僅參與了眾多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展，而且在肥胖相關疾病——2型糖尿病中起重要作用。此外，Apelin還與腎臟疾病也有一定的關系。

表1 糖尿病亞組和健康對照組Apelin基因rs2235306位點多態(tài)性分布比較[例(%)]

注：與NC組比較,aχ2=4.591,P<0.05;bχ2=4.082,P<0.05

表2 糖尿病組Apelin基因rs2235306位點多態(tài)性與其他臨床指標的關系

注：BMI為體質指數(shù)，WC為腰圍，SBP為收縮壓，DBP為舒張壓，TC為總膽固醇，TG為三酰甘油，HDL-C為高密度脂蛋白膽固醇，LDL-C為低密度脂蛋白膽固醇，F(xiàn)PG為空腹血糖,HOMA-IR為胰島素抵抗指數(shù)，下表同

Apelin 表達分布廣泛，在腎臟組織和血管內皮細胞都有表達。體外研究表明Apelin-APJ系統(tǒng)以自分泌或旁分泌的方式誘導內皮細胞增殖，促進新生血管形成[6]。Zhang等[7]研究發(fā)現(xiàn)Apelin通過促進腎小球上皮細胞增殖和增加腎小球毛細血管的通透性兩方面在糖尿病腎病發(fā)生中發(fā)揮作用。曾翔俊等[8]的研究也表明Apelin/APJ在2型糖尿病小鼠及2型糖尿病患者腎臟組織中表達上調，上調表達的Apelin/APJ系統(tǒng)促進腎小球微血管內皮細胞形成血管樣結構并促進2型糖尿病小鼠腎小球毛細血管增生，從而參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。人類Apelin 基因位于X染色體q25-26.1段，含有3個外顯子和2個內含子，mRNA長度是2673 bp。rs2235306位點存在于Apelin基因啟動子區(qū)，存在T-C的變異，本研究發(fā)現(xiàn)MA組CC基因型及C等位基因頻率高于NC組(P<0.05)，NA組CC基因型頻率及C等位基因頻率與NC組比較差異無統(tǒng)計學意義，因此推測Apelin基因rs2235306位點C等位基因攜帶可能與2型糖尿病早期腎損害有關。

胰島素抵抗是早期糖尿病腎病的獨立危險因素，而Apelin/APJ系統(tǒng)與肥胖、胰島素抵抗密切相關。Krist等[9]研究發(fā)現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗患者的血清Apelin水平明顯升高，而且減少脂肪組織Apelin的表達有助于提高胰島素敏感性。國內黎英榮等[10]研究發(fā)現(xiàn)血清Apelin濃度與血清胰島素水平和HOMA-IR呈正相關。本研究結果顯示糖尿病組人群TC+CC基因型組與TT基因型組比較，F(xiàn)Ins、HOMA-IR和Apelin水平明顯升高，多元逐步回歸分析顯示HOMA-IR和BMI是Apelin的獨立相關因素，提示Apelin與胰島素抵抗密切相關。因此，推測Apelin 可能在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。

Apelin是一種新發(fā)現(xiàn)的調節(jié)肽，目前關于Apelin和APJ在基因水平與疾病的相關性研究尚未普遍開展，因此，Apelin基因多態(tài)性與糖尿病腎病的相關性機制還需進行大樣本的深入研究和探索。