王 凡 李永玉 彭彥昆 孫宏偉 李 龍

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京100083)

1 引言

番茄紅素(Lycopene)是一種類胡蘿卜素，它具有較強(qiáng)的抗氧化性[1]，對(duì)人類內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡有抑制作用，并被證實(shí)可以降低癌癥和心血管疾病的患病率[2]。番茄紅素廣泛存在于自然界中，在番茄果實(shí)中的含量最為豐富，是天然番茄紅素的主要來源。番茄紅素是番茄最重要的營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)之一[3，4]，因此生鮮番茄中番茄紅素的快速無損檢測對(duì)鮮食番茄以及加工番茄的品質(zhì)分級(jí)均有著重要的意義。

傳統(tǒng)番茄紅素的檢測方法主要有分光光度計(jì)法和高效液相色譜法[5，6]，這兩種方法均需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，對(duì)樣品有破壞性且耗時(shí)較長，難以滿足現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測及分級(jí)需求。近紅外光譜技術(shù)是一種快速、無損、可在線檢測的技術(shù)，操作簡單、穩(wěn)定性好，現(xiàn)已成為果蔬品質(zhì)快速無損檢測的有效方法[7～11]。番茄紅素是一種不飽和烯烴化合物，由11個(gè)不飽和共軛雙鍵和2個(gè)非共軛不飽和雙鍵組成的長鏈脂肪烴，而650～950 nm范圍內(nèi)包含CH的三級(jí)和四級(jí)倍頻[12，13]，因此，可見/近紅外光譜可以反映番茄中番茄紅素的含量。目前，基于可見近紅外光譜的果蔬品質(zhì)的快速無損檢測研究報(bào)告很多，也有一些有關(guān)番茄紅素的相關(guān)研究報(bào)道。如利用可見/近紅外漫反射光譜對(duì)番茄中番茄紅素含量進(jìn)行定量檢測[14～16]，也有針對(duì)生鮮番茄總糖、總酸、硬度等品質(zhì)進(jìn)行無損檢測研究[17]的報(bào)道，但此前的研究方法并不能直接應(yīng)用于預(yù)測番茄紅素含量，首先是因?yàn)橄啾扔诳偺?、總酸這類品質(zhì)，番茄紅素在番茄中含量較低，檢測難度較高，使用簡單的建模分析難以達(dá)到檢測精度要求;其次，之前的研究為單點(diǎn)漫透射檢測，但番茄紅素的分布常不均勻，當(dāng)更換檢測位置時(shí)，檢測結(jié)果差異較大，難以反映樣品整體番茄紅素的含量。現(xiàn)階段的商化漫透射近紅外檢測裝置，大部分以環(huán)形光導(dǎo)為光源，探頭位于光源中心，僅能獲取部分的樣品信息。

針對(duì)番茄內(nèi)外部結(jié)構(gòu)特征，本研究選擇透射檢測方式，通過獲取生鮮番茄整體透射光譜信息，對(duì)番茄紅素含量進(jìn)行無損傷快速檢測研究，旨在建立一種可靠的番茄紅素含量快速無損檢測方法，為番茄分級(jí)加工提供技術(shù)支撐。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 番茄樣品

番茄樣品采自北京市延慶縣某蔬菜種植基地，由于番茄紅素主要影響番茄的顏色，為擴(kuò)大樣品區(qū)間，摘取不同成熟度的西紅柿:紅熟前期番茄18個(gè)，紅熟中期番茄22個(gè)，紅熟后期番茄24個(gè)[18]，共78個(gè)中果(100～149 g)，代表性樣品如圖1所示。所有番茄采摘后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，置于溫度為6℃、相對(duì)濕度為20%的環(huán)境下貯藏24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 紅熟前期番茄(A)、紅熟中期番茄(B)、紅熟后期番茄(C)的圖片和(D)紅熟中期番茄剖面圖

Fig.1 Illustration of turning tomato(A)，light red tomato(B)，red tomato(C)and section of light red tomato(D)

2.2 可見/近紅外透射光譜系統(tǒng)的搭建與光譜采集

為采集完整番茄的透射光譜，搭建了番茄可見/近紅外無損檢測系統(tǒng)，包括光源、光譜儀、光纖、電腦和電源等，如圖2所示，光源系統(tǒng)主要分為3部分:環(huán)形光源、燈架內(nèi)壁和環(huán)形膠墊。環(huán)形光源由8個(gè) 5 W的鹵素?zé)糁?1206-U，Welch Allyn，America)組成。燈架內(nèi)壁可以將番茄果梗與檢測光源分隔，防止果梗部分對(duì)檢測的影響。環(huán)形膠墊安裝在燈架外壁，保護(hù)番茄樣品表面不受熱損傷的同時(shí)避免光源的外漏。由于透射光譜信號(hào)較弱，因此在光纖前端安裝了具有聚焦功能的聚焦透鏡，起到對(duì)信號(hào)的放大作用，同時(shí)擴(kuò)大了信號(hào)接收面積，從而獲得番茄的整體信息。因短波近紅外部分(700～1100 nm)比長波近紅外(1100～2526nm)在水果內(nèi)部有更深的穿透深度[19]，光譜儀選用美國海洋光學(xué)公司的STS微型光譜儀(STS-NIR，Ocean Optics，America)，它的波段響應(yīng)范圍為650～1100 nm，在此區(qū)間內(nèi)包含CH鍵的三倍頻和四倍頻吸收的信息，而番茄紅素是由11個(gè)不飽和共軛雙鍵和2個(gè)非共軛不飽和雙鍵組成的長鏈脂肪烴，因此該波段可以用于預(yù)測番茄紅素的含量。

采集番茄透射光譜時(shí)，將番茄果梗向下放置于環(huán)形膠墊上，調(diào)整光纖的高度，使聚焦透鏡與番茄表面接觸，設(shè)置積分時(shí)間為100 ms，平均次數(shù)為5次，光譜儀的設(shè)置由海洋光學(xué)的Spectrasuite軟件完成。為了消除光源波動(dòng)帶來的干擾，檢測時(shí)使用5 mm厚的聚四氟乙烯板作為光學(xué)參考標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 番茄紅素理化標(biāo)準(zhǔn)值的檢測

每個(gè)番茄樣品采集完光譜信息后，基于分光光度法方法[20]對(duì)樣品的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)理化值進(jìn)行測定。首先稱取番茄紅素(YY91604-20 mg，上海源葉生物科技有限公司)，用少量無水乙醇溶解稀釋，配制相當(dāng)于2、5、10、15、20、25和30 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后依次測得其在485 nm下的吸光度，以測得的濃度作為縱坐標(biāo)，番茄紅素濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 可見/近紅外透射光譜檢測系統(tǒng)示意圖(A)和光源結(jié)構(gòu)圖(B)

Fig.2 Diagramofvisible/nearinfrareddiffuse transmission spectrum detection system(A)and Focus lens(B)

將番茄在高速組織離心機(jī)中攪拌60 s，經(jīng)甲醇脫水并去除其中的黃色素后，用甲苯提取番茄紅素，最后用分光光度法測量提取液的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得番茄紅素的含量。經(jīng)測量，本次實(shí)驗(yàn)中，番茄紅素含量范圍為6.1～24.0 mg/kg，平均值為14.1 mg/kg。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品理化值分析

在建立模型過程中，校正集的選取十分重要，常用的劃分方法有隨機(jī)法(Random stone，RS)、KS法(Kennard-stone)[21，22]、SPXY法(Sample set partitioning based on joint x-y distances)[23]等。RS法隨機(jī)性較大，所選取出的樣品缺乏代表。KS法根據(jù)光譜差異劃分，忽略了化學(xué)值的重要性。SPXY算法綜合考慮光譜值和化學(xué)值對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行劃分，因此該方法劃分出的訓(xùn)練集更具有代表性，泛化能力更強(qiáng)。本研究選擇SPXY算法將85個(gè)樣品分為校正集和驗(yàn)證集，各品質(zhì)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)信息如表1所示。

3.2 光譜與光譜預(yù)處理

番茄紅素在番茄中主要以紅色素的形式存在，隨著成熟度的提高，番茄表皮由綠色變?yōu)榧t色，同時(shí)其內(nèi)部化學(xué)成分與結(jié)構(gòu)也發(fā)生一定變化，為了對(duì)比不同番茄紅素含量的番茄透過率光譜曲線的差異，按照番茄成熟度分為變色期、淺紅色和紅色3個(gè)等級(jí)，3種不同成熟度番茄的平均吸光度光譜如圖3所示。3種成熟度的番茄光譜趨勢較為一致，受678 nm處的葉綠素吸收峰影響，光譜在650～710 nm區(qū)間內(nèi)吸光度逐漸下降，在710～820 nm區(qū)間內(nèi)呈穩(wěn)定趨勢，在760 nm處有明顯的OH拉伸第三泛音引起的吸收帶。對(duì)比3種成熟度的光譜可知，番茄成熟度越高，吸光度越低，這是由于成熟的過程中果膠不斷降解，水分含量逐漸增多導(dǎo)致的[24]。

表1校正集和驗(yàn)證集中各品質(zhì)參考值Table 1Reference measurements of quality attributes in calibration and verification sets

圖3 番茄不同成熟度吸光度光譜對(duì)比:a.紅熟前期番茄光譜;b.紅熟中期番茄光譜;c.紅熟后期番茄光譜

Fig.3 Comparison of absorbance spectra of different ripeness tomatoes.a.Turning phase tomato;b.Light red phase tomato;c.Red phase tomato

為減少番茄透射光譜中非目標(biāo)信息的干擾，提高光譜與待測組分的相關(guān)性，對(duì)原始光譜進(jìn)行了預(yù)處理，以優(yōu)化或消除其它因素對(duì)圖譜信息的影響[25～27]。本研究利用MATLAB分析軟件，用去趨勢(Detrend，DT)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(Standard normal variable transformation，SNV)、多元散射校正(Muliplication scattering correction，MSC)、歸一化(Normalize，NOR)、一階導(dǎo)數(shù)(First derivative，F(xiàn)D)對(duì)原始光譜進(jìn)行了預(yù)處理，處理結(jié)果如圖4所示。其中，DT、SNV、MSC原理為通過不同參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)樣品進(jìn)行校正，從而將光散射信號(hào)與化學(xué)吸收信息進(jìn)行分離，NOR主要實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)縮放功能，使分布復(fù)雜的數(shù)據(jù)限制在一定范圍內(nèi)，F(xiàn)D通過對(duì)光譜的導(dǎo)數(shù)處理，能有效消除基線漂移，但同時(shí)會(huì)使光譜的信噪比降低。

3.3 番茄紅素預(yù)測模型的建立

本研究選擇偏最小二乘(Partial least squares，PLS)作為建模方法，對(duì)預(yù)處理后的光譜分別建立PLS模型，利用校正集相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient of calibration，Rc)、校正集均方根誤差(Root mean square error of calibration，RMSEC)、驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficient of validation，Rv)、驗(yàn)證集均方根誤差(Root mean square error of validation，RMSEV)、交叉驗(yàn)證均方根誤差(Root mean square error of cross validation，RMSECV)判定模型的精度和穩(wěn)定性。

圖4 原始光譜(A)、去趨勢(B)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(C)、多元散射校正(D)、歸一化(E)、一階導(dǎo)數(shù)(F)、去趨勢+一階導(dǎo)數(shù)(G)、去趨勢+標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(H)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換+一階導(dǎo)數(shù)(I)后的番茄吸光度光譜

Fig.4 Tomato raw absorbance spectra(A)and spectra after detrend(B)，standard normal variable transformation(C)，muliplication scattering correction(D)，normalized(E)，first derivative(FD(F)，Detrend(DT)+FD(G)，DT+standard normal variable transformation(SNV)(H)and SNV+FD(I)

PLS模型主因子數(shù)是模型的重要參數(shù)，因子數(shù)過低時(shí)模型精度不足，因子數(shù)過高易出現(xiàn)過擬合的現(xiàn)象，因此本研究利用RMSECV選擇最優(yōu)因子數(shù)，不同預(yù)處理方法的RMSECV變化如圖5所示，隨著主因子數(shù)的增加，RMSECV呈現(xiàn)先下降后保持相對(duì)穩(wěn)定的趨勢，當(dāng)獲得較小RMSECV同時(shí)RMSEV與RMSECV無明顯大小差異時(shí)，判定為最優(yōu)主因子數(shù)。最優(yōu)主因子數(shù)下的建模結(jié)果如表2所示。與原始光譜相比，經(jīng)不同預(yù)處理后的PLS模型效果均有提高，其中SNV預(yù)處理的模型效果最好，Rc和Rv別為0.9771和0.9504，RMSEC和RMSEV分別為0.9711和1.0496 mg/kg。

3.4 變量波長的篩選

在全光譜建模中，雖然番茄紅素與光譜表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性，但光譜共有942個(gè)變量，其中包含了大量無關(guān)信息和共線性變量，這些無意義的波長不但會(huì)增加模型的復(fù)雜度，而且會(huì)對(duì)模型造成干擾降低模型的精度[28]。變量選擇是近紅外光譜分析中的一個(gè)重要部分，本研究選擇無信息變量消除法(Uninformative variable elimination，UVE)[29，30]、連續(xù)投影算法(Successive projections algorithm，SPA)[31]、競爭性自適應(yīng)重加權(quán)算法(Competitive adaptive reweighted sampling，CARS)[32，33]對(duì)全光譜進(jìn)行變量優(yōu)選。

表2不同預(yù)處理方法的校正結(jié)果Table 2Results of calibration and validation with different pretreatments

Note:Rc:correlation coefficient of calibration;Rv:correlation coefficient of validation;RMSEC:Root mean square error of calibration; RMSEV:Root mean square error of validation.

UVE是一種基于回歸系數(shù)建立的變量選取方法。首先人為添加一個(gè)隨機(jī)噪聲矩陣，以噪聲值作為閾值，剔除不提供信息的變量，減少模型中包含的變量數(shù)，降低模型的復(fù)雜性。圖6顯示了每個(gè)光譜波長與250個(gè)疊加噪聲相比的穩(wěn)定性，其中穩(wěn)定性值越大的變量對(duì)模型的貢獻(xiàn)率越高，而穩(wěn)定性值低于閾值的變量則被剔除。由于添加的噪聲具有隨機(jī)性，因此連續(xù)執(zhí)行30次，并最終獲得了294個(gè)波長變量。

圖5 不同預(yù)處理交叉驗(yàn)證均方根誤差變化

Fig.5 Variation of root mean square error of cross validation(RMSECV)with different pretreatments

MSC:muliplication scattering correction;NOR:normalize.

圖6 UVE-PLS變量篩選方法的光譜穩(wěn)定性分布

Fig.6 Stability of spectral variables by uninformative variable elimination-partial least square(UVE-PLS) method

SPA是一種向前變量篩選方法，通過選定一個(gè)初始波長，每一次迭代時(shí)加入新的波長，直至達(dá)到指定的波長數(shù)量，通過這種投影分析，從光譜矩陣提取有效信息，并使光譜變量共線性達(dá)到最小。圖7顯示了SPA-PLS方法用不同數(shù)量變量進(jìn)行交叉驗(yàn)證的RMSECV趨勢結(jié)果。隨著選定波長數(shù)量的增加，PLS模型的RMSECV值趨于變小，然后大致不變。當(dāng)選擇變量為33個(gè)時(shí)，RMSECV最小，為0.9748 mg/kg。

CARS方法是另一種變量選擇方法，該算法模仿達(dá)爾文進(jìn)化理論中“適者生存”的原則，對(duì)不適應(yīng)模型的波長進(jìn)行淘汰。圖8A為波長變量篩選過程中被選中波長變量數(shù)量的變化趨勢，圖8B為波長變量篩選過程中RMSECV的變化趨勢;圖8C為波長變量篩選過程中各波長變量回歸系數(shù)的變化趨勢。由圖8可知，在1～22次采樣過程中，與番茄紅素?zé)o關(guān)的變量被剔除，RMSECV的值不斷降低;隨著采樣次數(shù)增加，RMSECV逐漸上升，這是因?yàn)樵谧兞亢Y選的過程中剔除掉了與番茄紅素相關(guān)的變量。根據(jù)RMSECV最小原則，最終選擇的采樣次數(shù)為22次，波長變量數(shù)為67個(gè)。以上3種不同的變量選擇方法均能夠起到對(duì)模型的優(yōu)化作用。其中UVE側(cè)重于對(duì)不穩(wěn)定變量的刪除，在避免過度擬合的同時(shí)提高模型的精度，但穩(wěn)定變量不等于有用變量，經(jīng)過UVE后的變量數(shù)過多，仍然需要進(jìn)一步篩選。而SPA和CARS均側(cè)重于有用信息的保留，雖然最終選擇的變量數(shù)較少，但并不能避免大量不穩(wěn)定變量對(duì)篩選過程的干擾，因此，將UVE選擇后的變量分別進(jìn)行SPA和CARS處理(處理過程同上)，并分別得到了35和67個(gè)波長。將5種方法得到的波長輸入PLS，建模結(jié)果如表3所示。相比于全光譜建模，5種變量選擇后的模型精度都有了一定的提升，其中，UVE-SPA保留了最少的變量數(shù)(33個(gè))，但相應(yīng)的模型的精度最差，UVE-CARS保留了67個(gè)變量數(shù)，其模型精度最好，RMSEV為0.7680 mg/kg。

圖7 SPA-PLS變量篩選方法的RMSECV趨勢

Fig.7 RMSECV tendency of variable selection by successive projections algorithm(SPA)-PLS method

圖8 CARS-PLS變量篩選圖波長變量數(shù)量的變化趨勢(A)、RMSECV的變化趨勢(B)和回歸系數(shù)的變化趨勢(C)

Fig.8 Plot of variable selection by competitive adaptive reweighted sampling(CARS)-PLS:(A)trends in the numberofwavelengthvariables，(B)changesin RMSECV and(C)trends in the regression coefficients

表3不同預(yù)處理方法的校正結(jié)果Table 3Results of calibration and validation by variable selection methods

3.5 番茄紅素預(yù)測模型驗(yàn)證

選擇未參與建模的25個(gè)樣品作為預(yù)測集，通過PLS模型和UVE-CARS-PLS模型對(duì)25個(gè)樣品進(jìn)行了番茄紅素含量的預(yù)測，并根據(jù)分光光度法測定了其番茄紅素含量，預(yù)測值與測量值散點(diǎn)圖如圖9所示。UVE-CARS-PLS模型的預(yù)測集相關(guān)系數(shù)為0.9812，預(yù)測集均方根誤差為0.7071 mg/kg，平均相對(duì)誤差為4.3%。而作為比較的PLS模型的預(yù)測集相關(guān)系數(shù)為0.951，均方根誤差為1.0610，平均相對(duì)誤差6.0%。相比于簡單PLS模型，UVE-CARS可以很大程度地簡化模型，提高模型精度，降低檢測的誤差限。

圖9 UVE-CARS-PLS和PLS模型的番茄紅素預(yù)測集散點(diǎn)圖

Fig.9 Scattered plot of predicted value versus measured value of lycopene by UVE-CARS-PLS and PLS

4 結(jié)論

基于自行搭建的番茄可見/近紅外透射光譜檢測系統(tǒng)，采集了完整番茄的透射光譜并進(jìn)行了分析。在85個(gè)樣本的PLS模型中，SNV預(yù)處理結(jié)合UVE-CARS篩選特征波長獲得了較好的預(yù)測精度，其校正集和驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)分別為0.9830和0.9741，均方根誤差分別為0.6919 mg/kg和0.7680 mg/kg。在25個(gè)樣本的獨(dú)立驗(yàn)證中，預(yù)測值和實(shí)測值相關(guān)系數(shù)為0.9812，預(yù)測集均方根誤差為0.7071 mg/kg，平均相對(duì)誤差為4.3%。結(jié)果表明，可見/近紅外光譜與番茄紅素之間相關(guān)性較高，可以通過自行搭建的番茄可見/近紅外透射檢測系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)番茄紅素含量的預(yù)測，且通過特征波長提取能夠有效的簡化模型并提高預(yù)測精度。相比于傳統(tǒng)檢測方法，本方法耗時(shí)短，無需對(duì)番茄進(jìn)行破碎處理，因此也避免了傳統(tǒng)試驗(yàn)中易出現(xiàn)的番茄紅素氧化引起的誤差，但其預(yù)測模型是建立在傳統(tǒng)檢測方法的基礎(chǔ)上，因此精度略低于化學(xué)方法，因此研究仍有提高的空間。