賀茂芳 張 博 唐一梅 韓 祿

(西安醫(yī)學院藥學院，西安醫(yī)學院藥物研究所， 西安 710021)

1 引 言

離子交換色譜(Ion-exchange chromatography, IEC)是生物大分子最常用的分離純化手段之一[1～3]。根據(jù)固定相表面離子交換基團的帶電性質(zhì)，可分為陽離子交換和陰離子交換固定相；根據(jù)官能團的解離能力，又可分為強陽/陰離子交換和弱陽/陰離子交換固定相[3]。蛋白質(zhì)在離子交換固定相上的保留與固定相表面電荷的性質(zhì)和數(shù)量密切相關。理論上，固定相表面的電荷數(shù)量越多，即離子交換容量越大，與之發(fā)生交換的反離子越多，因此柱容量越大，分離純化的產(chǎn)量越高。

目前，固定相的制備大多是將小分子功能團直接鍵合在基質(zhì)表面，該方法鍵合的配基密度小，造成固定相的離子交換容量低[4,5]。隨著生物工程和生物制藥的快速發(fā)展，現(xiàn)有固定相已經(jīng)難以滿足復雜生物樣品的分離純化要求。因此，制備新型高容量離子交換固定相具有重要意義。研究表明，向材料表面引入聚合物大分子是提高吸附容量的有效手段[6,7]。原子轉(zhuǎn)移自由基聚合、超支化反應等是向材料表面引入聚合物的常用方法，然而，這些反應條件苛刻、過程復雜，限制了其在實際中的應用[8～10]。聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine, PEI)是一種陽離子聚合物，其分子骨架和支鏈上都含有大量的氨基。在較低pH值時，高密度的氨基被質(zhì)子化，可通過靜電作用吸附帶負電荷的物質(zhì)。因此，PEI是一種理想的離子交換配體，將其用于固定相的制備，可有效提高固定相的離子交換容量[11]。目前，PEI主要用于制備離子交換樹脂[12～15]。Hong 等[14]用PEI修飾瓊脂糖凝膠，對BSA和γ-乳球蛋白的吸附容量分別達到(273±9) mg/mL和(192 ± 14) mg/mL。然而，PEI大分子容易阻塞樹脂的多孔結構，增加傳質(zhì)阻力，不利于生物大分子的快速分離純化。

Fe3O4磁性納米粒子的生物相容性好、性質(zhì)穩(wěn)定、比表面積大，且具有易于分離、表面易修飾等優(yōu)點，是十分理想的納米載體[16,17]。目前，以Fe3O4為基質(zhì)制備的磁性吸附劑廣泛應用于蛋白質(zhì)、多肽的分離富集[18]。例如將硼親和磁性微球[19]、固定金屬親和磁性微球[20,21]用于糖蛋白/糖肽、磷酸化蛋白/磷酸化肽的分離富集，不僅操作簡便，而且具有較高的吸附容量和選擇性。本研究將Fe3O4與PEI結合，制備新型高容量陰離子交換磁性吸附劑用于蛋白質(zhì)的分離純化，反應條件溫和無毒，分離過程簡便易操作，提高了蛋白質(zhì)分離純化的效率，具有良好的實際應用前景。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Cary 60紫外可見分光光度計(美國安捷倫公司)；Hitachi H600透射電子顯微鏡(日本日立公司)；STA600熱重分析儀(美國Perkin-Elmer儀器公司)；TENSOR 27傅立葉紅外光譜儀(德國布魯克公司)；TS-211BQ型恒溫振蕩器 (上海島析實業(yè)有限公司)；SB-5200DT型超聲清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

多巴胺鹽酸鹽(分析純，北京百靈威科技有限公司)；PEI (Mr=1800，98%，上海純晶實業(yè)有限公司)； 牛血清白蛋白(BSA)、β-酪蛋白、溶菌酶、核糖核酸酶A(純度>98%, 美國Sigma-Aldrich公司)；其余試劑均為分析純。

2.2 實驗方法

2.2.1陰離子交換磁性微球的制備(1) Fe3O4的制備 參照文獻[22]，采用水熱法制備Fe3O4磁性納米粒子： 將1.3 g FeCl3、0.4 g檸檬酸酸鈉、2.0 g無水乙酸鈉溶于30 mL 乙二醇中，攪拌30 min后轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應釜，200℃反應12 h。反應結束后，磁分離移去上層溶液，所得磁性微球用水、乙醇依次洗滌。(2) Fe3O4表面包覆聚多巴胺 參照文獻[23]，將1.0 g Fe3O4分散于500 mL 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.5)，向其中加入1.0 g多巴胺，超聲分散2 min，常溫下機械攪拌反應12 h后，得到聚多巴胺包覆的Fe3O4(Fe3O4@pDA)，依次用Tris-HCl緩沖液、水和乙醇多次洗滌產(chǎn)物，備用。(3) PEI的接枝 將Fe3O4@pDA分散于30 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS, pH 8.5)，加入PEI 1.0 mL，60℃反應12 h，得到PEI型陰離子交換磁性微球(Fe3O4@pDA@PEI)，用水和乙醇交替洗滌多次，45℃真空干燥后，備用。

2.2.2離子交換容量的測定Fe3O4@pDA@PEI的離子交換容量采用AgCl沉淀滴定法測定[13]。0.5 g Fe3O4@pDA@PEI分散于20 mL 1.0 mol/L NaCl溶液中，振蕩30 min，傾去上清液，再加入NaCl溶液，振蕩，如此重復3次，以使Fe3O4@pDA@PEI與Cl——充分交換。用50 mL 0.1 mol/L HCl和 200 mL 0.1 mmol/L HCl依次洗滌微球，除去游離的Cl——。最后，將磁性微球分散于20 mL 10% Na2SO4溶液中，振蕩1h，將上清液全部合并，用0.1 mol/L AgNO3溶液滴定其中的Cl——濃度，即可計算離子交換容量。

2.2.3吸附時間的優(yōu)化稱取10.0 mg Fe3O4@pDA@PEI于離心管中，加入3.0 mL 濃度為0.5 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液 (用pH=7.0, PBS配制)，置于25℃恒溫搖床中振蕩(150 r/min)，設定振蕩時間為1、2、4、8和12 h (平行3次實驗)。振蕩結束后，用紫外可見分光光度法(λ=280 nm)測定上層溶液的濃度，按公式(1)計算吸附量。

Q=(C0-Ce)×V/m

(1)

式中，Q為吸附量(μg/mg)，C0為吸附前蛋白質(zhì)溶液的初始濃度(mg/mL)，Ce為吸附后蛋白質(zhì)溶液的平衡濃度(mg/mL)，V為溶液的體積(mL)，m為吸附劑的質(zhì)量(mg)。

2.3.4吸附pH值的優(yōu)化稱取10.0 mg Fe3O4@pDA@PEI于離心管中，加入3.0 mL 0.5 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液(分別配制于pH=6.0、7.0、8.0、9.0的緩沖液中)，在25℃以150 r/min振蕩2 h后，測定上清液的濃度，按公式(1)計算吸附量。

2.3.5靜態(tài)吸附等溫線的測定將10.0 mg Fe3O4@pDA@PEI分散于一系列不同濃度的蛋白質(zhì)溶液 (pH=7.0 PBS) 中，在25℃以150 r/min振蕩2 h后，測定上清液的濃度，按式(1)計算吸附量并繪制吸附等溫線。以同樣的方法測定Fe3O4@pDA@PEI對β-酪蛋白、溶菌酶和核糖核酸酶A的靜態(tài)等溫吸附線。

利用Langmuir方程(公式(2))對吸附等溫線進行擬合[24]，以計算飽和吸附容量。

(2)

式中，Q為吸附量(μg/mg)，C0為蛋白質(zhì)溶液的起始濃度(mg/mL)，Ce為吸附平衡時蛋白質(zhì)溶液的濃度(mg/mL)，Kd是解離常數(shù)(mg /mL)，Qm是飽和吸附容量(μg/mg)。

3 結果與討論

3.1 Fe3O4@pDA@PEI的制備與表征

Fe3O4@pDA@PEI的制備路線如圖1所示。根據(jù)文獻[25]報道，多巴胺在堿性條件(pH>7.5)下易被氧化，從而發(fā)生自聚反應，生成聚多巴胺，聚多巴胺可通過兒茶酚基自發(fā)地吸附在材料表面，形成聚多巴胺涂層。因此，本研究將Fe3O4納米粒子分散于2.0 mg/mL的多巴胺溶液中，調(diào)節(jié)溶液至pH 8.5，在常溫下攪拌反應12 h，使聚多巴胺吸附在Fe3O4表面，得到Fe3O4@pDA。一方面，聚多巴胺涂層增加了材料的穩(wěn)定性和親水性，有利于磁性微球在水溶液中均勻穩(wěn)定地分散，增加了表面功能團與溶質(zhì)分子接觸的機會；另一方面，聚多巴胺分子中含有豐富的兒茶酚基，在堿性條件下，兒茶酚氧化形成苯醌，與氨基發(fā)生席夫堿反應或邁克爾加成反應，將PEI大分子直接鍵合在Fe3O4@pDA表面[26]，得到Fe3O4@pDA@PEI。經(jīng)測定，F(xiàn)e3O4@pDA@PEI的陰離子交換容量為9.1 mmol/g。

圖1 陰離子交換磁性微球的制備路線(Fe3O4@pDA:聚多巴胺包覆的Fe3O4，F(xiàn)e3O4@pDA@PEI： PEI型陰離子交換磁性微球)Fig.1 Synthetic route of anion exchange magnetic microspheres (Fe3O4@pDA: polydopamine coated Fe3O4; Fe3O4@pDA@PEI: polyethyleneimine (PEI)-type anion exchange magnetic microspheres)

通過透射電子顯微鏡對磁性微球的形貌和尺寸進行了表征。如圖2所示，F(xiàn)e3O4的分散性好、表面粗糙，直徑約300 nm (圖2A)；經(jīng)過聚多巴胺包覆后(圖2B)，材料表面平滑且可觀察到明顯的“核殼”結構，微球的直徑增至350 nm左右，說明在Fe3O4表面包覆了一層厚度約50 nm的聚多巴胺。

圖2 Fe3O4(A)和Fe3O4@pDA(B)的透射電鏡(TEM)圖Fig.2 Transmission electron microscopy (TEM) images of (A) Fe3O4 and (B) Fe3O4@pDA

利用熱重分析法測定了Fe3O4表面聚合物的含量，如圖4所示。當溫度由25℃升高到200℃時，F(xiàn)e3O4(圖4a)、Fe3O4@pDA(圖4b)和Fe3O4@pDA@PEI(圖4c)的質(zhì)量損失率分別為6.2%、8.5%和10.3%，可能是材料中殘余溶劑的揮發(fā)所致；當溫度繼續(xù)升高時，F(xiàn)e3O4在200℃～400℃間質(zhì)量下降12.4%，為其表面沉積的乙酸鈉所致[27]，F(xiàn)e3O4@pDA和Fe3O4@pDA@PEI在200℃～600℃間質(zhì)量分別下降了24.8%和30.4%，說明Fe3O4表面聚多巴胺的含量約為24.8%，PEI的含量約為5.6%。

圖3 傅里葉變換紅外光譜圖：(a)Fe3O4, (b)Fe3O4@pDA, (c)Fe3O4@pDA@PEIFig.3 Fourier transform infrared (FT-IR) spectra of (a) Fe3O4, (b)Fe3O4@pDA and (c) Fe3O4@pDA@PEI

圖4 熱重分析曲線：(a)Fe3O4, (b)Fe3O4@pDA, (c)Fe3O4@pDA@PEIFig.4 Thermogravimetric analysis (TGA) of (a)Fe3O4, (b)Fe3O4@pDA and (c)Fe3O4@pDA@PEI

3.2 Fe3O4@pDA@PEI對蛋白質(zhì)的吸附性能

3.2.1吸附時間的優(yōu)化為了提高分離純化效率，以β-酪蛋白和BSA為模型蛋白對吸附時間進行研究。如圖5所示，吸附時間達到2 h以上時，吸附量升高不再明顯。此微球?qū)Φ鞍踪|(zhì)的最佳吸附時間為2 h。

3.2.2pH值的影響在離子交換色譜中，pH值對吸附容量的影響是pH值對蛋白質(zhì)和吸附劑表面電荷共同作用的結果。本研究以β-酪蛋白和BSA為模型蛋白，研究了Fe3O4@pDA@PEI對蛋白質(zhì)的吸附量隨pH值的變化情況。β-酪蛋白的等電點為4.0，BSA 的等電點為4.9，理論上，當溶液的pH值大于蛋白質(zhì)的等電點時，蛋白質(zhì)表面帶凈的負電荷，并且隨著pH值的升高，所帶電荷量增多；而Fe3O4@pDA@PEI微球表面含有伯胺、叔胺和仲胺，當溶液的pH值升高時，微球表面的正電荷逐漸減少，與蛋白質(zhì)的作用減弱。如圖6所示，當pH值從6.0增加到9.0時，F(xiàn)e3O4@pDA@PEI對蛋白質(zhì)吸附容量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當pH=7.0時，吸附量為最大值。因此，F(xiàn)e3O4@pDA@PEI對蛋白質(zhì)吸附的最佳pH值為7.0。

圖5 吸附時間對蛋白質(zhì)吸附量(Q)的影響： a, β-酪蛋白； b，牛血清白蛋白Fig.5 Effect of adsorption time on adsorption amount (Q) of protein: a, β-casein; b, bovine serum albumin (BSA)

圖6 pH值對蛋白質(zhì)吸附量(Q)的影響: a, β-酪蛋白; b, BSAFig.6 Effect of pH on the adsorption amount (Q) for protein: a, β-casein; b, BSA

3.2.3靜態(tài)吸附等溫線在最佳吸附時間和pH值條件下，首先測定了Fe3O4、Fe3O4@pDA和Fe3O4@pDA@PEI對BSA的靜態(tài)吸附等溫線(圖7)。Fe3O4@pDA@PEI對BSA的吸附量遠高于Fe3O4和Fe3O4@pDA對BSA的吸附量，說明PEI的引入大大提高了磁性微球的離子交換容量，從而有效提高了對蛋白質(zhì)的吸附能力。為了進一步考察Fe3O4@pDA@PEI的選擇性，實驗測定了Fe3O4@pDA@PEI對兩種酸性蛋白(BSA、β-酪蛋白)和兩種堿性蛋白(溶菌酶、核糖核酸酶A)的靜態(tài)吸附等溫線(圖8)。Fe3O4@pDA@PEI對蛋白質(zhì)的吸附量隨著蛋白質(zhì)溶液濃度的增加而逐漸增大，最后達到飽和。但是，F(xiàn)e3O4@pDA@PEI對β-酪蛋白和BSA吸附量要遠高于溶菌酶和核糖核酸酶，這與微球表面的電荷性質(zhì)以及蛋白質(zhì)的等電點有關。當溶液的pH=7時，β-酪蛋白和BSA帶凈的負電荷，與Fe3O4@pDA@PEI發(fā)生靜電吸引作用，因而微球?qū)λ鼈兙哂休^高的吸附容量；而溶菌酶、核糖核酸酶帶凈的正電荷，與Fe3O4@pDA@PEI發(fā)生靜電排斥作用，因此微球?qū)λ鼈兓静划a(chǎn)生吸附。因此，F(xiàn)e3O4@pDA@PEI對酸性蛋白具有良好的選擇性。

圖7 不同材料對BSA的靜態(tài)吸附等溫線: a, Fe3O4@pDA@PEI；b，F(xiàn)e3O4@pDA；c，F(xiàn)e3O4Fig.7 Static adsorption isotherm of (a) Fe3O4@pDA@PEI, (b) Fe3O4@pDA and (c) Fe3O4 for BSA

圖8 Fe3O4@pDA@PEI對不同蛋白質(zhì)的靜態(tài)吸附等溫線：a，β-酪蛋白；b，BSA；c，溶菌酶；d，核糖核酸酶AFig.8 Static adsorption isotherm of Fe3O4@pDA@PEI for different proteins: a, β-casein; b, BSA; c, Lysozyme; d, Rnase A

經(jīng)Langmuir擬合發(fā)現(xiàn)，對于β-酪蛋白和BSA，其Ce/Q與Ce之間存在良好的線性關系，線性方程分別為Ce/Q=0.00421Ce+0.36(r=0.993)和Ce/Q=0.00489Ce+0.52(r=0.985)，因此β-酪蛋白和BSA在Fe3O4@pDA@PEI微球上的吸附屬于典型的Langmuir單分子層吸附[24]。經(jīng)計算，β-酪蛋白和BSA的最大吸附容量分別為237.5和204.5 μg/mg。與文獻[28～30]報道的陰離子交換吸附劑相比(表1)，F(xiàn)e3O4@pDA@PEI不僅具有較高的吸附容量，而且具有較快的吸附動力學，能夠在較短時間內(nèi)達到吸附平衡，提高了蛋白質(zhì)分離純化效率。

表1 不同陰離子交換吸附劑的性能比較

Table 1 Comparison of different anion exchange absorbents

基質(zhì)Support離子交換基團Ion exchange ligand蛋白質(zhì)Protein靜態(tài)吸附容量Static adsorptioncapacity(μg/mg)平衡時間Equilibrationtime(h)參考文獻Reference聚4-乙烯基芐氯季銨鹽Poly(4-vinyl benzyl chloridequaternary ammonium) 4-乙烯基芐氯季銨鹽4-Vinyl benzyl chloridequaternary ammonium 牛血清白蛋白 BSA50胰蛋白酶 Trypsin22510[28]SiO2聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨Poly (methacrylatoethyltrimethyl ammonium chloride) 卵清蛋白Ovalbumin8024[29]瓊脂糖凝膠Agarose gel鹽酸2-氯三乙胺Diethyl chloroethyl aminehydrochloride 牛血清白蛋白BSA134.5未給出Not given[30]Fe3O4聚乙烯亞胺 PEI牛血清白蛋白BSA204.5β-酪蛋白β-Casein237.52本文This work

3.3 重復利用性能

圖9 重復利用次數(shù)對吸附容量的影響Fig.9 Effect of recycle times on adsorption capacity

將50.0 mg Fe3O4@pDA@PEI 微球重復進行吸附-洗脫-吸附實驗，重復8次，測定吸附容量。如圖9所示，重復利用7次后，吸附容量有所下降，但仍保持在初始容量的75%左右。因此，F(xiàn)e3O4@pDA@PEI 具有較好的重復利用性能和穩(wěn)定性。

4 結 論

將樹枝狀陽離子聚合物PEI成功鍵合在Fe3O4@pDA表面，制備了一種新型高容量陰離子交換磁性吸附劑。此材料制備方法簡單，反應條件溫和無毒，具有較高的陰離子交換容量和蛋白質(zhì)吸附容量；同時，磁性納米吸附劑在分離純化過程中具有操作簡便、快速等優(yōu)點。制備的此陰離子交換磁性吸附劑在生物大分子的分離純化方面具有良好的應用前景。