明超 曾云 熊敏

[摘要] 目的 觀察經(jīng)小腦延髓移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）對(duì)受損脊髓白質(zhì)的修復(fù)作用。 方法 改良Allen法構(gòu)建大鼠脊髓損傷（SCI）模型，隨機(jī)分成模型組和BMSCs組。BMSCs組給予10 μL BMSCs懸液，模型組給予等量生理鹽水。BBB評(píng)分評(píng)估術(shù)后1、7、14、21、28 d神經(jīng)功能恢復(fù)情況，4.7 T核磁掃描儀研究大鼠脊髓白質(zhì)變化；HE染色觀察SCI后的病理變化；熒光顯微鏡檢測(cè)Hoechst 33342標(biāo)記的BMSCs數(shù)目。 結(jié)果 SCI術(shù)后7、14、21、28 d BMSCs組BBB評(píng)分均顯著高于模型組（P < 0.05），BMSCs組脊髓白質(zhì)縱向彌散梯度接近于模型組（P > 0.05）。BMSCs組脊髓病灶中心平均面積明顯小于模型組（P < 0.05）。HE染色顯示BMSCs組14、28 d脊髓損傷的恢復(fù)情況明顯優(yōu)于模型組。BMSCs組術(shù)后7 d Hoechst 33342標(biāo)記的細(xì)胞信號(hào)水平高于模型組，隨后從7 d到1個(gè)月逐漸降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 經(jīng)小腦延髓移植BMSCs對(duì)受損脊髓白質(zhì)的恢復(fù)有著積極的促進(jìn)作用，這為SCI的治療提供了一種新途徑。

[關(guān)鍵詞] 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；小腦延髓；脊髓損傷；脫髓鞘改變

[中圖分類號(hào)] R744 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）08（a）-0009-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of bone marrow stem cells （BMSCs） transplanted via cisterna magna on the rehabilitation of damaged spinal cord white matter. Methods The spinal cord injury （SCI） model was carried out by a modified Allen method， assigned into the control group and BMSCs group randomly. The BMSCs group and control group were given 10 μL BMSCs suspension and 10 μL physiological saline via cistern magna respectively. BBB scale was utilized to estimate the neurological recovery on 1， 7， 14， 21， 28 d postoperatively after SCI. The white matter changes in the injured spinal cord were tested using 4.7 T MRI scanner. HE staining was applied to access the rehabilitation condition. Flourescence microscope was performed to identify the signal level of Hoechst 33342 marked BMSCs in the injured spinal cord. Results The BBB scores in the BMSCs group were significantly higher than that of the control group on 7， 14， 21， 28 d after SCI （P < 0.05）. There was no statistically significant difference between the two groups regard to the longitudinal diffusion gradients of the damaged spinal cord white matter （P > 0.05）. The average size of the lesion center in the BMSCs group was significantly smaller than that of the control group （P < 0.05）. HE staining revealed that the recovery of the BMSCs group was better than the control group at 14， 28 d after SCI. The counts of Hoechst 33342 labelled cells were less in the control group than that in the BMSCs group at 7 d. Subsequently， they continued to decrease from 7 d to 4 weeks later， with highly statistically significant difference （P < 0.01）. Conclusion Bone marrow mesenchymal stem cells transplanted via cisterna magna has a positive role in promoting the rehabilitation of damaged spinal cord white matter， which is a novel way of treating SCI.

[Key words] Bone marrow stem cells； Cisterna magna； Spinal cord injury； Demyelinating changes

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）的恢復(fù)是再生醫(yī)學(xué)中的一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）具有良好可塑性及分化成不同類型細(xì)胞的能力，占骨髓單核細(xì)胞總數(shù)的0.001%～0.01%，而且隨年齡增加而減少[1]。研究證實(shí)它們除了可以分化為骨骼、軟骨、脂肪及肌肉細(xì)胞等外，還能夠分化為神經(jīng)元類似細(xì)胞及心肌細(xì)胞，并且能夠分泌一系列保護(hù)因子如腦源性生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等[2-3]。近年來(lái)，學(xué)者對(duì)BMSCs的特征、分離及分化的調(diào)控進(jìn)行了大量研究。研究表明，BMSCs治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷時(shí)，能夠刺激肺巨噬細(xì)胞和脾臟調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生而發(fā)揮遠(yuǎn)程“生物反應(yīng)器”作用，進(jìn)而促進(jìn)循環(huán)系統(tǒng)中抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并改善其微環(huán)境[4]，同時(shí)也可以與移植區(qū)域的細(xì)胞溝通，從而分泌保護(hù)因子，促進(jìn)損傷恢復(fù)[5]。Tsumuraya等[6]發(fā)現(xiàn)，在小鼠脊髓橫斷損傷模型中，通過(guò)激活腦垂體腺嘌呤環(huán)化酶激活多肽基因，BMSCs可以通過(guò)降低促炎因子表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)抗炎因子表達(dá)從而抑制炎性反應(yīng)，修復(fù)損傷組織。BMSCs移植治療SCI的途徑眾多，而經(jīng)小腦延髓移植卻少見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)將探討經(jīng)小腦延髓途徑移植BMSCs到大鼠SCI部位后對(duì)受損脊髓白質(zhì)的影響，從而為SCI的治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

SPF級(jí)雌性SD大鼠45只飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內(nèi)[湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（鄂）2016-0031]，40只（3月齡，250～300 g）采用隨機(jī)數(shù)表法分成模型組（n = 20）和BMSCs組（n = 20），5只（2～3周齡，45～65 g）用于獲取BMSCs。試劑：DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清（美國(guó)GBICO公司）；兔抗大鼠CD34、小鼠抗大鼠CD90及CD105、驢抗小鼠FITC及PE、驢抗兔PE（英國(guó)abcam公司），HE染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器

脊髓損傷打擊器（美國(guó)Keck神經(jīng)外科研究中心）、大鼠腦定位儀（美國(guó)Stoelting公司）、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）、CKX41倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、XSP-63X熒光顯微鏡（日本Nikon公司）、FACS流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）、4.7 T核磁掃描儀（英國(guó)Resonance Instruments公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型構(gòu)建 改良Allen法構(gòu)建大鼠SCI模型[7]。術(shù)后分籠喂養(yǎng)，每日行人工排尿兩次，直至自主排尿功能恢復(fù)。

1.3.2 BMSCs分離培養(yǎng) 2～3周齡SD大鼠斷頸處死，取雙側(cè)股骨和脛骨，剪開(kāi)骨髓腔，2%FBS-DMEM反復(fù)沖洗髓腔獲取單細(xì)胞懸液離心、棄上清，混勻后接種于T25培養(yǎng)瓶中。細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48 h沖洗去除未貼壁的造血細(xì)胞，每2～3天換液1次。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代。

1.3.3 BMSCs表型鑒定 第三代BMSCs胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，分別加入兔抗大鼠CD34、小鼠抗大鼠CD90及CD105 1 μL（1∶50），混勻后4℃避光孵育1 h，PBS洗滌后加入驢抗小鼠FITC、驢抗兔、驢抗小鼠PE 1 μL（1∶50），混勻后室溫避光孵育20 min，離心后加入500 μL PBS，轉(zhuǎn)移至流式管上機(jī)。

1.3.4 BMSCs標(biāo)記及移植 第三代對(duì)數(shù)期BMSCs移植前1 h加入Hoechst33342 20 μL標(biāo)記，制成終濃度為3×107/mL的BMSCs懸液備用。細(xì)胞移植同文獻(xiàn)報(bào)道方法[8-9]。BMSCs組給予10 μL Hoechst 33342標(biāo)記的細(xì)胞懸液（約3×107/mL），模型組給予等量生理鹽水。

1.3.5 大鼠神經(jīng)功能評(píng)估 參照BBB評(píng)分[10]評(píng)估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。兩組大鼠分別在術(shù)后1、7、14、21、28 d取4只采用雙盲、二人獨(dú)立評(píng)分評(píng)估雙后肢恢復(fù)情況。

1.3.6 形態(tài)學(xué)評(píng)估 采用4.7 T核磁掃描儀掃描脊髓白質(zhì)獲取矢狀面和軸向T2加權(quán)和彌散加權(quán)圖像，參數(shù)如下：回聲時(shí)間（TE=32 ms）、重復(fù)時(shí)間（TR=3 s）、視野（FOV=2.5 cm）、圖像大?。?28×128）、切片厚度（1.5 mm）。信號(hào)累積（NA=6）以提高信噪比，所有測(cè)量與大鼠呼吸節(jié)律一致從而消除運(yùn)動(dòng)偽影。

1.3.7 脊髓取材及HE染色 術(shù)后1、14、28 d于兩組隨機(jī)選取2只大鼠麻醉后經(jīng)升主動(dòng)脈灌注4℃生理鹽水250 mL后改用4%多聚甲醛溶液250 mL。隨后取出T10脊髓組織固定后行HE染色。

1.3.8 BMSCs計(jì)數(shù) 大鼠灌注參照上文所述，脊髓取出后在冰凍切片機(jī)中制作T9～11連續(xù)橫切片（4 μm）。每只動(dòng)物取10張片，熒光顯微鏡下記錄Hoechst 33342標(biāo)記BMSCs數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)觀察及表面標(biāo)志物鑒定

大鼠原代BMSCs培養(yǎng)24 h后逐漸貼壁，呈圓形，含較多雜細(xì)胞；48 h后細(xì)胞形態(tài)呈多樣化，形態(tài)不規(guī)則。7～10 d可見(jiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)克隆式生長(zhǎng)，融合成梭形或多角形，呈漩渦狀或放射狀排列。第三代BMSCs形態(tài)規(guī)整、排列整齊，呈長(zhǎng)梭形。流式細(xì)胞儀鑒定BMSCs表面標(biāo)志物陽(yáng)性率分別為CD34 1.51%、CD90 98.9%、CD105 99.9%。見(jiàn)圖1～2。

2.2 脊髓損傷形態(tài)學(xué)改變

SCI術(shù)后7 d內(nèi)所有大鼠后肢運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)功能喪失。術(shù)后1 d，中度損傷大鼠可見(jiàn)脊髓組織連續(xù)性中斷、表面變性壞死，損傷周?chē)鷧^(qū)域亦有不同程度的變性壞死，假手術(shù)組大鼠脊髓完整，未見(jiàn)明顯出血壞死。見(jiàn)圖3。

2.3 BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分

SCI后第1天BMSCs組與模型組BBB運(yùn)動(dòng)評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。第7天開(kāi)始，BMSCs組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 SCI后HE染色形態(tài)變化

模型組術(shù)后1 d脊髓組織內(nèi)灰、白質(zhì)界限不清，可見(jiàn)大量片狀出血，細(xì)胞數(shù)目減少，呈現(xiàn)一片“荒蕪”現(xiàn)象。術(shù)后14 d脊髓組織內(nèi)神經(jīng)纖維排列疏松、斷裂，神經(jīng)元細(xì)胞稀少，膠質(zhì)細(xì)胞增生，可見(jiàn)空洞及瘢痕形成。術(shù)后28 d模型組灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元有所恢復(fù)，白質(zhì)被瘢痕組織侵蝕、連接，瘢痕組織內(nèi)未見(jiàn)明顯的神經(jīng)纖維再生。BMSCs組術(shù)后1 d脊髓內(nèi)可見(jiàn)點(diǎn)、片狀出血，細(xì)胞腫脹、消失；術(shù)后14 d受損脊髓組織局部空洞，少量瘢痕組織形成，神經(jīng)細(xì)胞較多；術(shù)后28 d脊髓組織內(nèi)無(wú)明顯空洞及瘢痕組織形成，有大量神經(jīng)細(xì)胞分布于脊髓組織內(nèi)。見(jiàn)圖4。

2.5 核磁量化分析白質(zhì)恢復(fù)情況

MRI結(jié)果顯示，BMSCs組脊髓白質(zhì)未出現(xiàn)創(chuàng)傷后囊腫，而模型組可見(jiàn)明顯的創(chuàng)傷后脊髓空洞癥。術(shù)后28 d，脊髓白質(zhì)彌散參數(shù)量化數(shù)據(jù)（表2）示，BMSCs組脊髓白質(zhì)縱向彌散梯度接近于模型組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），且這些結(jié)果接近于正常參考值。BMSCs組脊髓病灶中心平均面積明顯小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.6 BMSCs遷移數(shù)目測(cè)定

熒光顯微鏡觀察示術(shù)后7 d BMSCs組損傷處Hoechst 33342陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著高于模型組（圖5），從第7天開(kāi)始，BMSCs組脊髓損傷部位Hoechst 33342陽(yáng)性細(xì)胞信號(hào)水平開(kāi)始下降，由第7天的（968.5±321.7）個(gè)/mm2逐步下降至第1個(gè)月的（71.8±48.2）個(gè)/mm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 5.318，P < 0.01）。

3 討論

脊髓分灰質(zhì)和白質(zhì)，灰質(zhì)主要由神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成，白質(zhì)主要由軸突組成。與其它研究不同，本研究關(guān)注細(xì)胞移植治療脊髓白質(zhì)損傷的效果，而非神經(jīng)元。結(jié)果表明，經(jīng)小腦延髓移植BMSCs能促進(jìn)SCI大鼠形態(tài)學(xué)恢復(fù)，并改善其運(yùn)動(dòng)功能。雖然熒光顯微鏡下證實(shí)BMSCs隨著損傷時(shí)間延長(zhǎng)，數(shù)目減少，這可能與SCI后微環(huán)境惡劣有關(guān)，但不可否認(rèn)的是大鼠運(yùn)動(dòng)功能有所恢復(fù)。研究表明，BMSCs保護(hù)SCI有兩種可能的機(jī)制：限制創(chuàng)傷性SCI的程度、促進(jìn)細(xì)胞存活和軸突再生[11]。軸突脫髓鞘對(duì)神經(jīng)功能退化非常敏感，通過(guò)少突膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)髓鞘再生對(duì)于限制軸突變性至關(guān)重要，而后者則會(huì)導(dǎo)致受損區(qū)域向周邊脊髓組織擴(kuò)散[12-13]。最終，脊髓白質(zhì)會(huì)嚴(yán)重受損，形成典型的創(chuàng)傷后囊腫，這在人類和實(shí)驗(yàn)大鼠中都能觀察到。

BMSCs也可能通過(guò)影響細(xì)胞間聯(lián)系從而促進(jìn)損傷修復(fù)以及刺激軸突生長(zhǎng)。BMSCs分化除受細(xì)胞之間相互作用的影響，還受如損傷脊髓組織微環(huán)境的影響。因此，在復(fù)雜的SCI微環(huán)境中很難預(yù)測(cè)移植的BMSCs行為；但移植細(xì)胞向創(chuàng)傷區(qū)域遷移的能力決定了其向受損脊髓節(jié)段膠質(zhì)瘢痕區(qū)域滲透的能力，這在修復(fù)缺失的神經(jīng)功能中起到至關(guān)重要的作用。研究表明，移植的BMSCs能夠滲透進(jìn)入創(chuàng)傷后脊髓囊腫中，并能促進(jìn)大鼠脊髓軸突再生[14]，這可能與囊腔內(nèi)的BMSCs分化為脊髓細(xì)胞群有關(guān)。

經(jīng)小腦延髓移植是經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射移植治療SCI的方式之一。蛛網(wǎng)膜下腔移植途徑具有可多次注射、創(chuàng)傷小、不受血腦屏障限制、臨床可行性高等優(yōu)點(diǎn)[15]，在實(shí)踐中通常采用經(jīng)腰椎注射的方式。但在重力作用下，移植細(xì)胞大多停留在腰骶部，導(dǎo)致細(xì)胞移植效率降低。相比而言，經(jīng)小腦延髓移植具有更多優(yōu)勢(shì)。從腦脊液的生理循環(huán)來(lái)看，BMSCs在腦脊液循環(huán)及重力的雙重作用下可以最大程度到達(dá)SCI區(qū)域，從而改善移植細(xì)胞的存活、遷移、歸巢以及分化能力，促進(jìn)脊髓白質(zhì)再生[16-17]。研究證實(shí)BMSCs在促進(jìn)SCI后神經(jīng)功能恢復(fù)中的作用與移植細(xì)胞分化成某種特定的細(xì)胞群體無(wú)關(guān)[18]。在體外條件下，BMSCs能夠顯著改善神經(jīng)傳導(dǎo)作用[18]。Xiong等[19]研究表明盡管移植的BMSCs只有部分分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，但行為學(xué)評(píng)分證實(shí)SCI大鼠后肢功能得到顯著改善。

綜上所述，經(jīng)小腦延髓移植BMSCs對(duì)受損脊髓白質(zhì)的恢復(fù)有著積極的促進(jìn)作用，是一種有效的途徑。但是這些細(xì)胞修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的確切機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Neirinckx V，Agirman G，Coste C，et al. Adult bone marrow mesenchymal and neural crest stem cells are chemoattractive and accelerate motor recovery in a mouse model of spinal cord injury [J]. Stem Cell Res Ther，2015， 6（1）：211.

[2] Muto T，Miyoshi K，Horiguchi T，et al. Novel genetic linkage of rat Sp6 mutation to amelogenesis imperfect [J]. Orphanet J Rare Dis，2012，7（1）：1-11.

[3] Zeng YL，Zheng H，Chen QR，et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells overexpressing MiR-21 efficiently repair myocardial damage in rats [J]. Oncotarget，2017， 8（17）：29 161-29 173.

[4] 何佳，邱敏，熊偉，等.體外轉(zhuǎn)染GFP-Bcl-2基因?qū)Φ脱鯒l件下間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期的影響[J].骨科，2013，4（3）：113-116.

[5] Uccelli A，Moretta L，Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease [J]. Nat Rev Immunol，2008，8（9）：726-736.

[6] Tsumuraya T，Ohtaki H，Song D，et al. Human mesenchymal stem/stromal cells suppress spinal inflammation in mice with contribution of pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide （PACAP） [J]. Neuroinflammation，2015， 12（1）：35.

[7] Wang W，Huang X，Li J，et al. Methane suppresses microglial activation related to oxidative，inflammatory，and apoptotic injury during spinal cord injury in rats [J]. Oxid Med Cell Longev，2017，2017（8）：2 190 897.

[8] Damaso EL，Bonagamba LG，Kellett DO，et al. Involvement of central 5-HT 7 receptors in modulation of cardiovascular reflexes in awake rats [J]. Brain Res，2007，1144（1）：82-90.

[9] Solomon RA，Antunes JL，Chen RY，et al. Decrease in cerebral blood flow in rats after experimental subarachnoid hemorrhage：a new animal model [J]. Stroke，1985，16（1）：58-64.

[10] Lammertse DP. Update on pharmaceutical trials in acute spinal cord injury [J]. J Spinal Cord Med，2004，27（4）：319-325.

[11] 郭衛(wèi)春，李軍，熊敏，等.基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1/趨化因子受體4軸在促紅細(xì)胞生成素動(dòng)員骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷中的作用[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2015， 32（7）：1506-1509.

[12] Freund P，Curt A，F(xiàn)riston K，et al. Tracking changes following spinal cord injury：insights from neuroimaging [J]. Neuroscientist，2013，19（2）：116-128.

[13] Lee JY，Kang SR，Yune TY. Fluoxetine prevents oligodendrocyte cell death by inhibiting microglia activation after spinal cord injury [J]. J Neurotrauma，2015，32（9）：633-644.

[14] 石磊，鄭欣鵬，夏春，等.核因子-κB參與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖上調(diào)研究[J].骨科，2013，4（1）：7-10.

[15] Paul C，Samdani AR，F(xiàn)ischer I，et al. Grafting of human bone marrow stromal cells into spinal cord injury：a comparison of delivery methods [J]. Spine，2009，34（4）：328-334.

[16] Ye X，Yan T，Chopp M，et al. Combination BMSC and niaspan treatment of stroke enhances white matter remodeling and synaptic protein expression in diabetic rats [J]. Int J Mol Sci，2013，14（11）：22 221-22 232.

[17] Gu W，Zhang F，Xue Q，et al. Transplantation of bone marrow mesenchymal stem cells reduces lesion volume and induces axonal regrowth of injured spinal cord [J]. Neuropathology，2010，30（3）：205-217.

[18] Cantinieaux D，Quertainmont R，Blacher S，et al. Conditioned medium from bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves recovery after spinal cord injury in rats：an original strategy to avoid cell transplantation [J].PloS One，2013，8（8）：e69 515.

[19] Xiong M，Chen S，Yu HL，et al. Neuroprotection of erythropoietin and methylprednisolone against spinal cord ischemia-reperfusion injury [J]. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2011，31（5）：652-656.