薛天樂， 王 慶， 程 翔

(亳州職業(yè)技術學院 藥學院，安徽 亳州 236800)

白芷為傘形科植物白芷的干燥根，其用途廣泛，需求量較大?，F(xiàn)代科學研究表明，白芷主要含有香豆素類的活性物質，具有鎮(zhèn)痛消炎、抗氧化等作用，臨床上主要用于外科炎癥、皮膚科和婦科等疾病的治療[1]。白芷除藥用外，還被用來制作保健品、香料和化妝品等，雖然白芷在全國的種植面積不小，但是仍不能滿足市場需求，每年的缺口很大[2]。白芷中的主要有效成分為香豆素類的化合物，通過預試驗發(fā)現(xiàn)，白芷采收時被丟棄的部分也含有香豆素類成分，且白芷地上部分的體積較大，具有重大開發(fā)利用價值。然而，植物中的有效成分大部分處于細胞內，被較厚的細胞壁包裹，溶出度較低，白芷莖和葉相比，此類問題更加突出。纖維素酶可水解植物細胞壁的纖維結構，提高有效成分的提取率，在天然藥物的提取方面應用廣泛[3]。本試驗以白芷莖總香豆素的提取率為指標，采用正交設計，借助纖維素酶研究白芷莖的最佳提取工藝，希望對白芷地上部分的綜合開發(fā)利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

白芷莖采集自亳州市譙東鎮(zhèn)；歐前胡素產自中國食品藥品檢定研究院，批號：110826-201616；纖維素酶，CAS號：9012-54-8，分子量：45 000～75 000，山東西亞化學工業(yè)有限公司，批號：L54738；其他試劑均為分析純。紫外可見分光光度計(UV1901PC),上海奧析科學儀器有限公司；萬分之一電子分析天平(MF1204)上海亞津電子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗用溶液的制備 取歐前胡素約5 mg，精密稱定，用60%的乙醇定容于50 mL的容量瓶中，得標準品溶液。 分別稱取白芷莖干燥粗粉4.0 g，加120 mL提取溶劑，按照試驗設計，以不同的纖維素酶濃度、不同乙醇體積分數(shù)、不同提取溫度來提取，提取終點滅酶10.0 min，使用上述條件同時提取2次，合并濾液并濃縮，用60%乙醇定容于50 mL容量瓶中，得供試品溶液。

1.2.2 測定波長的選擇 在紫外區(qū)波段進行測定發(fā)現(xiàn)，標準品溶液和供試品溶液在300 nm處有共同的最大吸光度，有利于保證含量測定的準確性，且與文獻報道一致，故選擇300 nm為測定波長。

1.2.3 標準曲線的繪制 取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的標準品溶液，用60%的乙醇分別定容于10 mL的容量瓶中，于300 nm處測定吸光度(60%的乙醇溶液為空白溶液)，以吸光度為縱坐標(y)，標準品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(x)，繪制標準曲線，得曲線方程為：y=0.044 6x-0.022 4，R2=0.997，表明歐前胡素在濃度范圍4.6～20.3 μg/mL內具有良好的線性。

1.2.4 總香豆素的含量測定 準確吸取供試品溶液1.0 mL，用60%乙醇定容于50 mL容量瓶中，于300 nm處測定吸光度(60%的乙醇溶液為空白溶液)，利用線性求出總香豆素濃度，按下式計算總香豆素的提取率(R)。

上式中：C為利用線性求出總香豆素濃度(μg/mL)；N為稀釋倍數(shù)(n=50)；V為提取的供試品溶液的定容體積(50 mL)；M為樣品的質量(g)。

1.2.5 方法學驗證 (1)穩(wěn)定性考察 準確吸取供試品溶液1.0 mL，60%乙醇定容于50 mL容量瓶中，分別在0、2、4、8、12、24 h時測定其在300 nm處的吸光度(60%的乙醇為空白溶液)，結果RSD=1.6%，說明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。 (2)精密度考察 吸取標準品溶液1.0 mL置于10 mL的容量瓶中，用60%乙醇定容后在300 nm處測定其吸光度(60%的乙醇為空白溶液)，重復測定5次，結果RSD=0.3%。 (3)重復性考察 在相同工藝條件下制備5份供試品溶液，分別測定其在300 nm處的吸光度(60%的乙醇為空白溶液)，結果RSD=2.1%，說明重復性良好。 (4)加樣回收率考察 取已知含量的白芷莖的干燥粗粉5份，每份2 g，分別加標準品溶液5.0 mL，在相同工藝條件下制備5份供試品溶液，分別測算其總香豆素的提取率并計算加樣回收率，平均加樣回收率=100.43%，RSD=2.2%。

1.2.6 正交試驗 預試驗發(fā)現(xiàn)當料液比(g/mL)在1∶30及以上、提取時間在60 min及以上，提取率幾乎不再增加，在預試驗的基礎上，以總香豆素提取率為判斷指標，固定料液比(g/mL)為1∶30、提取時間為60 min，選取酶濃度(mg/mL)、乙醇體積分數(shù)、提取溫度3個因素為考察對象，設計L9(34)型正交表，按照“2.1”節(jié)的方法進行正交試驗(表1～2)。

2 結果與分析

2.1 正交試驗結果

表1 正交試驗結果

表2 方差分析

F0.05(2,2)=19.00; F0.01(2,2)=99.00。

綜合分析表1～2可知，各因素對白芷莖總香豆素提取率的影響主次順序為纖維素酶濃度>乙醇體積分數(shù)>提取溫度，其中纖維素酶濃度對白芷莖總香豆素提取率具有顯著影響。白芷莖總香豆素提取率最佳提取工藝條件為酶濃度2.0 mg/mL、乙醇體積分數(shù)45%、提取溫度55 ℃。

2.2 驗證試驗

稱取白芷莖的干燥粗粉3份，每份4.0 g，分別以最佳提取工藝進行提取，根據(jù)標準曲線及1.2.4節(jié)的方法進行測算，總香豆素提取率分別為1.55%、1.61%、1.59%，平均為1.58%。

2.3 不同提取法的比較

比較采用不同的提取方法白芷莖總香豆素的提取率，每種方法做3組平行試驗，提取率取平均值(表3)。

表3 不同提取方法的總香豆素提取率

由表3可知，纖維素酶法的總香豆素提取率可達1.56%，比傳統(tǒng)的加熱回流法和煎煮法分別提高了27.9%和64.2%。

3 結論與討論

本研究表明，白芷莖總香豆素提取率最佳提取工藝條件為酶濃度2.0 mg/mL、乙醇體積分數(shù)45%、提取溫度55 ℃。應用最佳工藝進行白芷莖總香豆素的提取率可達1.58%，比文獻報道的白芷根部的香豆素含量還要高[4-5]。同時，纖維素酶法具有提取條件溫和，提取率高等優(yōu)點[6-8]，和傳統(tǒng)的加熱回流法和煎煮法相比具有明顯的優(yōu)勢，說明該法可以用于白芷莖總香豆素的提取。

結合課題組前期研究[9]，可以看出，同樣以歐前胡素作為標準品，但是白芷葉和白芷莖的總香豆素紫外最大吸收峰是不一致的(白芷葉313 nm，白芷莖300 nm)，說明白芷葉和白芷莖中所含的香豆素類物質具有一定的差異性，研究時應注意區(qū)分。

近年來，資源相對不足已成為制約我國中醫(yī)藥發(fā)展的突出矛盾之一，對于藥用植物資源，應實行綜合評價與開發(fā)，以合理利用有效避免枯竭和浪費[10]。除白芷外，還有很多中藥如白芍、紫苑、桑白皮等都每年的需求量都很大，這些藥材傳統(tǒng)的藥用部位都是其根部，大量的地上部分被丟棄，造成環(huán)境污染和資源浪費。根據(jù)植物遺傳規(guī)律及次生代謝產物的分布，具有重要藥理作用的藥物往往不僅僅局限于某一器官，開展對此種藥材的非藥用部位進行研究具有重要意義[11-12]，本次研究結果對其他類似藥材的二次開發(fā)具有實際的借鑒價值。