柯丹霞，彭昆鵬，張孟珂，賈妍

(1.信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000;2.大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院，河南 信陽 464000)

半胱氨酸蛋白酶抑制劑(cystatin)在生物體內(nèi)廣泛存在[1]，是一類可以與半胱氨酸蛋白酶特異性結(jié)合，并抑制其蛋白水解酶活性的蛋白質(zhì)[2]。Cystatin蛋白首先被報道參與調(diào)控植物發(fā)育過程，包括嚴(yán)格控制植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的降解[3]，參與貯藏蛋白的沉積和調(diào)運等生理過程[4-6]。此外，cystatin蛋白通過調(diào)控半胱氨酸蛋白酶的活性，從而延緩葉片衰老過程。如康乃馨(Dianthuscaryophyllus)cystatin 基因Dc-CPIn可以抑制花瓣的萎蔫[7]。水稻(Oryzasativa)cystatin 基因OC-I在煙草(Nicotianatabacum)中的異源表達(dá)延長了煙草的營養(yǎng)生長階段，開花時間和葉片衰老過程被推遲[8]。蘋果(Malusprunifolia)cystatin 基因MpCYS4也能夠延緩葉片的衰老過程[9]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)cystatin基因在提高植物對非生物脅迫的抗性方面具有重要作用[10-11]。水稻cystatin 基因OC-I通過調(diào)控半胱氨酸蛋白酶活性影響植株對脅迫的抗性[12]。擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtCYS4和AtCYS5基因受高溫誘導(dǎo)表達(dá)，基因的過表達(dá)增強擬南芥的耐高溫能力[13-14]。蘋果MpCYS2[15]、MpCYS4[16]和MpCYS5[17]基因分別提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱、脫落酸(abscisic acid，ABA)和鹽脅迫的抗性。野生大豆(Glycinesoja) cystatin蛋白GsCPI14通過與鈣結(jié)合類受體蛋白激酶GsCBRLK相互作用，參與堿脅迫反應(yīng)[18]。另外，植物cystatin蛋白對鱗翅目、鞘翅目等有害昆蟲的生長抑制作用[19-20]以及cystatin參與植物對病原菌入侵的防御過程[21-22]等方面也得到了較為深入的研究。

綜上，大量證據(jù)表明植物cystatin基因在調(diào)控植株發(fā)育，提高植物對非生物脅迫和病蟲害的抗性等方面具有重要作用。但關(guān)于該類基因在豆科植物共生結(jié)瘤過程中的功能研究報道較少。目前已經(jīng)在大豆(Glycinemax)中分離并鑒定了20個cystatin基因，它們在大豆的14個不同組織中均有表達(dá)[23]，其中7個基因在根瘤中具有轉(zhuǎn)錄活性[24]。Yuan等[25]細(xì)致描述了20個大豆cystatin基因的全基因組特征，并對該類基因在接種根瘤菌后不同時期的根及根瘤中的表達(dá)特征進(jìn)行了檢測。其中，GmCYS20基因在接種后0.5 h的根中表達(dá)量迅速升高，在隨后的7～24 h、5、16以及21 d根中表達(dá)量持續(xù)上升，維持較高的轉(zhuǎn)錄水平。推測GmCYS20可能在大豆共生結(jié)瘤過程中發(fā)揮功能。為了明確該基因的生物學(xué)功能，本研究在前人工作基礎(chǔ)上克隆了大豆GmCYS20基因，在豆科模式植物百脈根中異源表達(dá)該基因，通過對復(fù)合體百脈根共生結(jié)瘤表型以及根瘤菌侵染表型的鑒定，揭示GmCYS20基因在共生結(jié)瘤過程中的功能，為進(jìn)一步闡明該類基因在豆科植物共生結(jié)瘤過程中的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆測序品種Williams82(W82)種子由中國科學(xué)院生態(tài)與地理研究所孔凡江研究員提供；百脈根(Lotusjaponicus)MG-20種子、改造的植物表達(dá)載體p1302G(攜帶GUS標(biāo)簽)、百脈根根瘤菌PN28(攜帶LacZ標(biāo)簽的MAFF303099菌株)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室張忠明教授提供。

1.2 GmCYS20基因的克隆和植物表達(dá)載體的構(gòu)建

W82大豆種子表面滅菌后，種臍朝下平鋪于無菌潤濕濾紙上，28 ℃暗培養(yǎng)待萌發(fā)。收集新鮮大豆根尖組織，液氮速凍。參照RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，USA)說明書，提取大豆根尖組織總RNA。按照TIANGEN公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明獲得cDNA 第一鏈。根據(jù)https://www.soybase.org/search/網(wǎng)站公布的大豆GmCYS20基因(Glyma.20g045500)序列設(shè)計引物F-GmCYS20和R-GmCYS20(表1)，PCR擴增GmCYS20目的基因?；厥漳康钠危B接T載體，送南京金斯瑞公司測序驗證。設(shè)計引入酶切位點EcoRI和SmaI的引物F-OX和R-OX(表1)，將測序正確的目的基因插入植物表達(dá)載體p1302G(Gus基因作為篩選標(biāo)記基因)中，構(gòu)建p1302G-GmCYS20重組質(zhì)粒，經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌LBA1334中備用。

1.3 序列分析

利用NCBI網(wǎng)站的Blastp工具尋找栽培大豆(Glycinemax)GmCYS20蛋白(NP_001239817.1)的同源蛋白，包括野生大豆(Glycinesoja，KHN35444.1)，綠豆(Vignaradiata，XP_014516943.1)，木豆(Cajanuscajan，XP_020236689.1)，赤豆(Vignaangularis，XP_017411678.1)，鷹嘴豆(Cicerarietinum，XP_012574834.1)，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XP_003599710.2)，狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius，XP_019419326.1)，紫花苜蓿(Medicagosativa，AAZ98791.1)，百脈根(AFK41117.10)，栽培花生(Arachishypogaea，CBX19819.1)，蔓花生(Arachisduranensis，XP_020995318.1)和落花生(Arachisipaensis，XP_016197069.1)共12種不同豆科植物的cystatin同源蛋白。利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源蛋白的多序列比對和進(jìn)化樹分析。

表1 本研究中所使用的引物Table 1 The primers used in this study

注：下劃線區(qū)域為酶切位點序列。

Note：The underline region indicates the restriction enzyme cutting sites.

1.4 百脈根的發(fā)狀根轉(zhuǎn)化

首先對百脈根種子進(jìn)行表面滅菌，置于潤濕濾紙上22 ℃黑暗培養(yǎng)，待其兩片子葉展開，下胚軸長至1 cm長時，剪去根部，獲得用于侵染的外植體。用攜帶有重組質(zhì)粒p1302G-GmCYS20的LBA1334農(nóng)桿菌菌懸液(OD600=0.6)浸泡外植體30 min，置于MS培養(yǎng)基上，22 ℃暗培養(yǎng)3～5 d。隨后將外植體移入含300 mg·L-1頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上，22 ℃培養(yǎng)2～3周，待發(fā)狀根長出后，標(biāo)記每一條發(fā)狀根并剪下發(fā)狀根根尖部分，浸泡于GUS染液[26]中37 ℃過夜反應(yīng)。觀察根尖顯色情況，與平板上的發(fā)狀根一一對應(yīng)，將不變藍(lán)的陰性發(fā)狀根徹底剪掉，留下變藍(lán)的陽性發(fā)狀根繼續(xù)培養(yǎng)。隨機挑選部分陽性發(fā)狀根，進(jìn)行RT-PCR檢測。提取陽性發(fā)狀根總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用表1中F-GmCYS20和R-GmCYS20引物擴增GmCYS20基因，以百脈根多聚泛素(Polyubiquitin，UBI)為內(nèi)參基因，引物為F-UBI和R-UBI。

1.5 復(fù)合體百脈根的結(jié)瘤試驗

將上述復(fù)合體植株種入無菌沙盆，煉苗2～3 d，第4天接種根瘤菌PN28，每天澆灌無氮營養(yǎng)液1次。接種4周后，分別將超表達(dá)GmCYS20復(fù)合體植株(GmCYS20-OX)和空載體對照p1302G復(fù)合體植株從沙盆中取出，用蒸餾水清洗根系，對結(jié)瘤表型進(jìn)行統(tǒng)計拍照。根據(jù)單株結(jié)瘤數(shù)和樣本量(n)，計算單株平均結(jié)瘤數(shù)，試驗重復(fù)兩次，取平均值，于2017年8月完成。

1.6 復(fù)合體百脈根的基因表達(dá)檢測

利用表1中GmCYS20和結(jié)瘤相關(guān)基因NIN、ENOD40-1和ENOD40-2的熒光定量引物檢測復(fù)合體植株陽性發(fā)狀根中各基因的轉(zhuǎn)錄水平，百脈根UBI基因作為內(nèi)參。按照Takara公司PrimeScript RT reagent Kit操作說明進(jìn)行熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測，根據(jù)相對定量法(2-△△Ct：用于比較不同樣品之間的變化比率)公式計算結(jié)果。試驗重復(fù)3次，采用Excel 2007和SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并繪制圖表。

1.7 復(fù)合體植株的根瘤菌侵染表型鑒定

同1.5結(jié)瘤試驗，復(fù)合體百脈根植株接種PN28根瘤菌10 d后，取出植株，將發(fā)狀根清洗干凈,每棵植株剪下2～4條4～6 cm左右的發(fā)狀根，放入2%戊二醛溶液中固定2～3 h，使內(nèi)源β-gal失活，然后用pH 7.4的PBS緩沖液清洗發(fā)狀根2～3次，去掉殘留的戊二醛溶液。最后將發(fā)狀根放入LacZ染液[27]中，30 ℃染色過夜。將染色處理后的發(fā)狀根轉(zhuǎn)移到PBS緩沖液中，制作水浸片，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)狀根中根瘤菌的侵染情況。按照根瘤菌吸附到根毛頂端、侵入線進(jìn)入根表皮、根瘤菌進(jìn)入根瘤原基和成熟根瘤形成這4個階段統(tǒng)計復(fù)合體植株發(fā)狀根中根瘤菌的侵染表型。試驗于2017年9月完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmCYS20基因的序列分析

根據(jù)大豆GmCYS20基因的已知序列設(shè)計引物，以大豆根尖組織cDNA為模板，PCR擴增目的條帶。經(jīng)測序驗證，克隆片段長度為291 bp，堿基數(shù)及序列與網(wǎng)站公布序列完全一致，說明已經(jīng)成功克隆了GmCYS20基因(圖1A)，該基因在大豆中的ID號是Glyma.20G045500，位于大豆基因組20號染色體的8475315～8478532位，含有2個外顯子和1個內(nèi)含子。序列分析表明(圖1B)，GmCYS20基因的CDS區(qū)編碼97個氨基酸殘基，蛋白質(zhì)的等電點(PI)為5.83，N端無信號肽，三維結(jié)構(gòu)包含2個α螺旋和6個β折疊。GmCYS20屬于第Ⅲ類cystatin蛋白，含有該家族共有的4個保守結(jié)構(gòu)域GG、LARFAVE、QVVSG和SW。

圖1 GmCYS20基因的克隆(A)和編碼氨基酸序列分析(B)Fig.1 Cloning of GmCYS20 gene (A) and analysis of encoded amino acid sequence (B) M: DL2000 DNA marker; 1: 目的片段 Target fragment; 下劃線氨基酸代表4個保守結(jié)構(gòu)域GG、LARFAVE、QVVSG和SW Underlined amino acids represent 4 conserved domains GG, LARFAVE, QVVSG and SW.

在NCBI網(wǎng)站上對GmCYS20基因的編碼序列進(jìn)行Blastp比對，尋找其他豆科植物中GmCYS20的同源蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GmCYS20與野生大豆、綠豆、木豆、赤豆、鷹嘴豆、 蒺藜苜蓿、狹葉羽扇豆、紫花苜蓿、百脈根、栽培花生、蔓花生和落花生等12種豆科植物的CYS蛋白相似性較高(圖2)。通過DNAMAN軟件獲得大豆GmCYS20蛋白與上述12種豆科植物CYS蛋白的進(jìn)化樹，由圖3可知，大豆GmCYS20蛋白與野生大豆CYS蛋白處在同一進(jìn)化分支上，親緣關(guān)系最近。

2.2 轉(zhuǎn)GmCYS20基因復(fù)合體百脈根的獲得

為了明確GmCYS20基因在共生結(jié)瘤過程中的生物學(xué)功能，在模式豆科植物百脈根中對GmCYS20基因進(jìn)行超量表達(dá)的研究。將克隆的GmCYS20基因插入改造過的植物表達(dá)載體p1302G中，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和SmaI雙酶切后獲得大小正確的載體片段和目的片段(圖4A)，將質(zhì)粒送交公司測序。利用凍融法將測序結(jié)果正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌LBA1334，鑒定后保存于-80 ℃，用于百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化。

參照1.4中的百脈根發(fā)狀根轉(zhuǎn)化流程，制備轉(zhuǎn)GmCYS20基因的復(fù)合體百脈根。首先對切口處新長出的發(fā)狀根進(jìn)行GUS染色。標(biāo)記每一條發(fā)狀根并剪下其根尖部分，浸泡于GUS染液中37 ℃過夜反應(yīng)。結(jié)果如圖4B所示，變藍(lán)的為陽性發(fā)狀根，箭頭所指為不變色的陰性發(fā)狀根。根據(jù)標(biāo)記，將平板上對應(yīng)的陰性發(fā)狀根徹底剪掉，留下陽性發(fā)狀根進(jìn)行盆栽試驗。復(fù)合體百脈根接種根瘤菌4周后，隨機挑選部分發(fā)狀根進(jìn)行GUS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)狀根均呈藍(lán)色(圖4C)。與此同時，隨機挑選部分發(fā)狀根，進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示，檢測的轉(zhuǎn)GmCYS20基因發(fā)狀根中均出現(xiàn)較強的轉(zhuǎn)錄信號，而空載體對照中沒有出現(xiàn)目的條帶(圖5)，說明外源基因GmCYS20已經(jīng)成功整合到GmCYS20-OX百脈根發(fā)狀根基因組中。

圖2 大豆GmCYS20與其他豆科植物同源蛋白的多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of GmCYS20 with its homologs in other leguminous plants

圖3 大豆GmCYS20與其他豆科植物同源蛋白的進(jìn)化樹分析Fig.3 The phylogenetic tree analysis of GmCYS20 with its homologs in other Leguminous plants 標(biāo)尺代表遺傳相似性，指不同植物間同源蛋白進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近。The scale represents genetic similarity, indicates the proximity relationships among species.

2.3 復(fù)合體百脈根的結(jié)瘤表型分析

對上述鑒定為陽性的復(fù)合體百脈根植株進(jìn)行結(jié)瘤試驗。接種根瘤菌4周后，統(tǒng)計GmCYS20-OX組和空載體對照組的結(jié)瘤表型發(fā)現(xiàn)，GmCYS20-OX組的單株平均結(jié)瘤數(shù)明顯高于對照組。GmCYS20-OX組的單株平均結(jié)瘤數(shù)為8.8個，而空載體對照組的單株平均結(jié)瘤數(shù)為16.1個(圖6)。說明GmCYS20基因在百脈根中的異源表達(dá)，能夠顯著增加百脈根根瘤數(shù)目，GmCYS20基因在百脈根的結(jié)瘤過程中起著積極的促進(jìn)作用。

圖4 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及陽性毛根的鑒定Fig.4 Construction of plant expression vector and identification of positive hairy roots A： p1302G-GmCYS20的酶切鑒定 Identification of p1302G-GmCYS20 by enzyme digestion; M: DL2000 DNA marker; 1： p1302G-GmCYS20的EcoR I 和 Sma I 雙酶切圖p1302G-GmCYS20 digested with EcoR I and Sma I; B：毛根根尖的GUS染色圖，箭頭所示為不顯藍(lán)色的陰性毛根 GUS staining of the hairy root apex. The arrowhead is shown as a negative hairy root apex that does not show blue; C：陽性毛根接種根瘤菌4周后的GUS染色圖 GUS staining of the positive hairy roots after inoculation with rhizobium for 4 weeks.

圖5 轉(zhuǎn)基因陽性毛根的分子生物學(xué)檢測Fig.5 Molecular detection of transgenic positive hairy roots 多聚泛素作為內(nèi)參基因 UBI was used as reference gene. M：DL2000 DNA marker；1：陽性對照(模板為質(zhì)粒) Plasmid as positive control；2：空載體對照 Empty vector control；3～8：轉(zhuǎn)基因陽性毛根 Transgenic positive hairy roots; 9：陰性對照(模板為水)ddH2O as positive control.

圖6 過量表達(dá)GmCYS20基因?qū)Π倜}根結(jié)瘤數(shù)目的影響Fig.6 Effect of overexpression GmCYS20 gene on nodule number in L. japonicus A：接種根瘤菌4周后復(fù)合體植株的結(jié)瘤表型 Nodulation of composite plants at 4 weeks of post inoculation with MAFF303099; GmCYS20-OX：超表達(dá)GmCYS20復(fù)合體植株 Composite plants overexpressing GmCYS20； CK：空載體p1302G復(fù)合體植株Composite plants expressing empty vector p1302G; Bars=10 mm.

2.4 轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中GmCYS20及結(jié)瘤指示基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測

圖7 熒光定量PCR檢測復(fù)合體植株中GmCYS20及 共生相關(guān)基因的表達(dá)Fig.7 Real-time PCR analysis of the transcription levels of GmCYS20 and symbiotic related genes in composite L. japonicus NIN：結(jié)瘤起始基因Nodulation initiation gene；ENOD40-1, ENOD40-2：結(jié)瘤素基因Nodulin genes；** 表示差異極顯著(P<0.01) ** represents extremely significant difference (P<0.01).

利用Real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中GmCYS20基因的表達(dá)，結(jié)果顯示GmCYS20基因在GmCYS20-OX發(fā)狀根中的表達(dá)水平為空載體對照(CK)的5.5倍(圖7)，說明植物超表達(dá)載體的構(gòu)建有效，GmCYS20基因在GmCYS20-OX發(fā)狀根中確實是過量表達(dá)的。接著檢測結(jié)瘤指示基因NIN、ENOD40-1和ENOD40-2在轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步分析GmCYS20基因的過量表達(dá)對結(jié)瘤指示基因表達(dá)水平的影響。結(jié)瘤起始基因NIN是侵入線和根瘤原基形成的關(guān)鍵基因，結(jié)瘤素基因ENOD40-1和ENOD40-2是根瘤起始和發(fā)育的關(guān)鍵基因[28]。由圖7可見，3個結(jié)瘤指示基因在GmCYS20-OX發(fā)狀根中的表達(dá)水平均顯著增加，特別是ENOD40-2基因，為對照的6.2倍。結(jié)果表明GmCYS20基因的過量表達(dá)上調(diào)結(jié)瘤指示基因的表達(dá)。

2.5 轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中根瘤菌的侵染表型分析

為了進(jìn)一步明確GmCYS20基因在根瘤形成的哪個階段發(fā)揮功能，對接種根瘤菌10 d的轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根進(jìn)行染色處理，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)狀根中根瘤菌侵染宿主植物及根瘤的形成過程。按照根瘤菌吸附到根毛頂端、侵入線進(jìn)入根表皮、根瘤菌進(jìn)入根瘤原基和成熟根瘤形成這4個階段統(tǒng)計復(fù)合體植株發(fā)狀根中根瘤菌的侵染表型(圖8A～D)。結(jié)果表明GmCYS20-OX復(fù)合體植株在根瘤菌進(jìn)入根瘤原基以及成熟根瘤形成這兩個階段的統(tǒng)計數(shù)目較對照明顯增多，而在根瘤菌吸附到根毛頂端和侵入線進(jìn)入根表皮這兩個階段與對照組并無明顯差異(表2)。說明GmCYS20-OX復(fù)合體植株根瘤數(shù)目的增多是由根瘤原基增多導(dǎo)致的，與根瘤菌的侵染無關(guān)。以上數(shù)據(jù)證實GmCYS20基因與根瘤的起始和發(fā)育相關(guān)，是一個重要的共生信號調(diào)節(jié)因子。

圖8 轉(zhuǎn)GmCYS20基因毛根中根瘤菌的侵染表型分析Fig.8 Rhizobial infection assay of transgenic hairy roots overexpressing GmCYS20 轉(zhuǎn)基因毛根接種攜帶LacZ標(biāo)簽的根瘤菌PN28 The transgenic hairy roots were inoculated with M. loti strain PN28 that constitutively expresses a lacZ marker.根瘤菌侵染表型分為根瘤菌吸附到根毛頂端(A)，侵入線進(jìn)入根表皮(B)，根瘤菌進(jìn)入根瘤原基(C)以及成熟根瘤的形成(D)4個類別 Rhizobial infection phenotypes included 4 categories: the position of the IT tips at the root hairs (A), at epidermis (B), at the nodule primordia (C) and at the mature nodule (D). 箭頭表示根瘤菌到達(dá)的部位，用于不同表型的統(tǒng)計Arrows indicate the characteristic features used for scoring the phenotypes. Bar=25 μm.

根瘤菌侵染表型The rhizobial infection phenotypeCK (n=30)GmCYS20-OX (n=30)根瘤菌吸附到根毛頂端The position of the IT tips at the root hairs4852侵入線進(jìn)入根表皮The position of the IT tips at the epidermis5849根瘤菌進(jìn)入根瘤原基The position of the IT tips at the nodule primordia4677成熟根瘤形成The position of the IT tips at the mature nodule4382

3 討論

百脈根是一種優(yōu)良的豆科牧草，其固氮作用能夠增加土壤肥力，因此被廣泛應(yīng)用于補播改良草場、建立人工放牧地和人工草地。同時，百脈根的細(xì)胞再生性能好，遺傳轉(zhuǎn)化效率高，目前已經(jīng)成為實驗室研究生物固氮機理、外源基因轉(zhuǎn)化和牧草品質(zhì)改良的模式豆科植物。Hansen等[29]利用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)最早建立了“復(fù)合體植株”系統(tǒng)，此系統(tǒng)主要由非轉(zhuǎn)化的地上部分和轉(zhuǎn)化的發(fā)狀根組成。發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百脈根發(fā)狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有遺傳操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高和穩(wěn)定性好等突出優(yōu)點。每個轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根代表一個獨立的轉(zhuǎn)化事件[30]。該系統(tǒng)目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物固氮領(lǐng)域基因功能的研究[31-34]。由于大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率相對較低，研究候選基因功能費時耗力[35]，因此本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百脈根發(fā)狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)來驗證大豆候選基因GmCYS20在共生結(jié)瘤途徑中的生物學(xué)功能，快速高效評價該候選基因在目標(biāo)作物——大豆中的育種利用價值。

半胱氨酸蛋白酶數(shù)量眾多且廣泛存在于豆科植物中，幾乎參與植物生長發(fā)育的各個方面，包括萌發(fā)、晝夜節(jié)律、植物衰老和程序性細(xì)胞死亡等，在根瘤發(fā)育、脅迫調(diào)節(jié)以及根瘤衰老控制過程中也有許多半胱氨酸蛋白酶參與其中[36]。研究表明，基因沉默紫云英(Astragalussinicus)半胱氨酸蛋白酶基因AsNODF32，根瘤發(fā)育和類菌體衰老被延緩，根瘤壽命被延長[37]。抑制蒺藜苜蓿半胱氨酸蛋白酶CYP15A也可以延緩根瘤的衰老[38]。苜蓿根瘤衰老的過程中伴隨著一個保守的半胱氨酸蛋白酶亞家族MtCP1～MtCP6的表達(dá)，此亞家族蛋白可能涉及共生體結(jié)構(gòu)的降解[39]，這些半胱氨酸蛋白酶的表達(dá)或活性受抑制因子的調(diào)控。豌豆半胱氨酸蛋白酶PsCyp15A基因的表達(dá)在根瘤開始衰老時被激活[40]。

1983年最早報道了大豆中18個半胱氨酸蛋白酶在根瘤發(fā)育和衰老過程中維持較高的轉(zhuǎn)錄水平[41]。綜合最新的大豆共生相關(guān)數(shù)字基因表達(dá)譜[42-43]以及根瘤樣品轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[24]發(fā)現(xiàn)，有28個Papain-like半胱氨酸蛋白酶可能參與結(jié)瘤、根瘤的發(fā)育及衰老，但是否存在特異的半胱氨酸蛋白酶參與調(diào)控根瘤的發(fā)育目前并不明確。半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白是半胱氨酸蛋白酶的天然抑制劑，明確其在根瘤發(fā)育中的作用，可有效揭示其調(diào)控的半胱氨酸蛋白酶參與根瘤發(fā)育的機理。本研究中獲得的大豆cystatin蛋白GmCYS20可能也是通過調(diào)控特異的半胱氨酸蛋白酶活性，從而參與根瘤的起始和發(fā)育過程。因此，進(jìn)一步點對點尋找GmCYS20蛋白對應(yīng)的半胱氨酸蛋白酶底物，驗證二者之間的相互作用及酶活調(diào)節(jié)機制對于闡明cystatin蛋白在共生結(jié)瘤過程中的分子調(diào)控機理具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究克隆了大豆的1個半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因GmCYS20，分析發(fā)現(xiàn)GmCYS20蛋白是一個典型的半胱氨酸蛋白酶抑制劑。通過對轉(zhuǎn)GmCYS20基因復(fù)合體百脈根植株的共生表型鑒定發(fā)現(xiàn)，GmCYS20基因正調(diào)控根瘤的起始與發(fā)育。研究結(jié)果揭示了GmCYS20基因在共生結(jié)瘤過程中的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步闡明該類基因在豆科植物共生結(jié)瘤過程中的分子機制奠定了理論基礎(chǔ)，同時，也為揭示豆科植物與根瘤菌的共生互作機制提供了新的分子生物學(xué)證據(jù)。