蘇建輝 ， 張 玉 ， 劉成祥 ， 馬朝陽 ， 聶榮京 ， 高傳忠 ， 王洪新 *

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051；3.國家功能食品工程技術(shù)研究中心，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；4.銅陵瑞璞牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，安徽 銅陵244000）

糖尿病是一種普遍的代謝紊亂癥，由胰島素分泌缺陷或胰島素敏感性降低引起，導(dǎo)致碳水化合物、脂類和蛋白質(zhì)代謝障礙[1]。心腦血管疾病在世界范圍內(nèi)逐年增長，降低膽固醇水平可以減少這種疾病的發(fā)病率[2]。藥用植物在一些國家已經(jīng)控制了糖尿病和高血脂[3-5]，成為安全有效降糖和降血脂藥物的主要來源。此外已經(jīng)從這些藥用植物中取得降血糖降血脂的功能性成分，例如，黃酮、皂甙、生物堿、多糖和不飽和脂肪酸等[6]。植物源的天然產(chǎn)物相比于合成產(chǎn)物，被認(rèn)為是毒性更小或者沒有副作用。多年來，這些植物已經(jīng)被用于治療醫(yī)學(xué)上的各種疾病。雖然一些傳統(tǒng)中藥或者提取物的降糖效果已經(jīng)被報道，但是復(fù)方降血糖效果很少被研究。正交t值法目前已被用于中藥主要成分研究[7-12]。目前已有很多天然產(chǎn)物被報道了對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、膽固醇酯酶和胰脂肪酶4種酶及膽固醇膠束溶解度的抑制效果。作者以5個指標(biāo)的抑制率為評價指標(biāo)，用正交t值法研究各功能因子的主要成分，加權(quán)綜合的方法分析協(xié)同效應(yīng)，D值優(yōu)化法確定復(fù)方配比。從天然產(chǎn)物中尋找對消化酶具有抑制活性的功能因子，為輔助治療高血糖、高血脂保健食品的配方研發(fā)提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物提取物 銀杏黃酮（95%）、EGCG、槲皮素、絞股藍(lán)皂甙、丹皮酚、魔芋多糖、葛根素純度為98%；枸杞多糖、玉竹多糖和苦瓜提取物 （苦瓜素）純度為80%以上，均購于南京景竹生物科技公司。牡丹籽油：銅陵瑞璞牡丹產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司產(chǎn)品。1.1.2 實驗試劑 可溶性淀粉、3，5-二硝基水楊酸、酚酞、橄欖油、麥芽糖、對硝基苯-β-D半乳糖吡喃 糖 苷 （p-Nitrophenyl α -D-glucopyranoside，PNPG）、95%乙醇、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、丙三醇均為國藥集團(tuán)分析純；α-葡萄糖苷酶、豬胰脂肪酶、α-淀粉酶、膽固醇脂肪酶購于西格瑪公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 α-淀粉酶活性抑制體系 取 50 μL α-淀粉酶（2 U/mL）和一定濃度抑制劑溶液，在37℃孵化10 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%可溶性淀粉1 mL，37℃反應(yīng)5 min后加入1 mL DNS試劑，沸水浴5 min，迅速冷卻后，稀釋至適當(dāng)倍數(shù)在520 nm波長測定吸光度（拜糖平為陽性對照）[3]。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶活性抑制體系 取PNPG 100 uL（10 mmol/L）加入 850 uL 磷酸緩沖液（PH 6.8）。再加入樣品溶液，空白對照（不加酶的反應(yīng)體系）以消除PNPG本身氧化產(chǎn)生對硝基苯酚（PNP）而影響測定結(jié)果。37℃孵化10 min，加入酶50 uL（2 U/mL），再孵化 50 min，加入 1 mL Na2CO3終止反應(yīng)。405 nm測吸光度（拜糖平為陽性對照）。

1.2.3 胰脂肪酶活性抑制體系 取50 mL三角瓶數(shù)個，每瓶加入5 mL 0.025 mol/L磷酸緩沖液和 1 mL橄欖油作為底物，置于40℃水浴保溫5 min，然后在瓶中（除空白外）各加入 50 μL酶液（5×100-400 U/mL），從加入脂肪酶開始精確計算時間，反應(yīng)5 min后，立即加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇15 mL，終止酶反應(yīng)，再加1%酚酞2～3滴，用0.025 mol/L氫氧化鈉滴定至淡紅色（胰脂肪酶為陽性對照）[14]。

1.2.4 膽固醇酯酶反應(yīng)體系 對膽固醇酯酶的抑制活性測試，測試溫度保持在（25.0±0.2）℃。所有的反應(yīng)在含有NaCl（0.1 mol/L）、對硝基苯基丁酸酯（4-Nitrophenyl butyrate，PNPB 0.2 mmol/L）、?；悄懰徕c （5.16 mmol/L）的磷酸鈉緩沖液 （0.1 mol/L，pH 7.0）中進(jìn)行。膽固醇酯酶預(yù)先溶解在高純水中20 ug/mL；底物PNPB和抑制劑預(yù)先溶解在乙腈中，在-20℃保存。加入豬胰腺膽固醇酯酶（0.72 U/mL）啟動反應(yīng)，25.0℃反應(yīng)5 min，在405 nm紫外可見分光光度計檢測[15]。

1.2.5 膽固醇膠束溶解度反應(yīng)體系 1 mL膠束溶液中含有 10 mmol/L?；悄懰徕c，2 mmol/L膽固醇，5 mmol/L 油酸，132 mmol/L 氯化鈉，15 mmol/L磷酸緩沖液 （pH 7.4）。超聲波均質(zhì)進(jìn)行制備。37℃隔夜靜置。將空白對照，一定量的功能因子分別加入到膠束溶液中，然后將混合溶液在37℃振蕩培養(yǎng) 2 h，并在 16 000 r/min離心 20 min，收集上清液用試劑盒測定膠束中膽固醇含量[16]。

1.2.6 正交t值法-主藥分析 將篩選出來的功能因子每種為一個因素，隨機(jī)命名為A、B、C、D、E等。分別是茶多酚、銀杏黃酮、牡丹籽油、絞股藍(lán)皂甙和苦瓜提取物。每個因素設(shè)2水平，水平1為添加，水平2為不添加。根據(jù)功能因子對應(yīng)α-淀粉酶和膽固醇酯酶IC50確定其在每組方中的比例用量。實驗選用L12（211）正交t值表進(jìn)行；各組通過對α-淀粉酶和膽固醇酯酶活性的抑制效果（0.5 mg/mL），加權(quán)綜合確定主成分（1∶1），數(shù)據(jù)越大，作用越強(qiáng)。通過數(shù)據(jù)分析找出主藥和輔藥。

1.2.7 輔藥交互作用 用正交t值和加權(quán)綜合分析方法（1∶1）分析輔藥和主藥及輔藥之間的相互作用，以功能因子對α-淀粉酶和膽固醇酯酶的活性抑制效果為檢測指標(biāo)。

1.2.8D值優(yōu)化法劑量配比 以各功能因子對α-淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶和膽固醇酯酶的IC50為劑量選擇依據(jù)，適當(dāng)增減。計算質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時功能因子不同劑量配比對α-淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶和膽固醇酯酶的抑制率。值越大，配比效果越好，選出最優(yōu)配比[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能因子對消化酶和膽固醇膠束溶解度抑制率體外研究

以0.5 mg/mL抑制劑對胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度的抑制效果為評價標(biāo)準(zhǔn)。由圖1可以看出EGCG對α-淀粉酶、胰脂肪酶和膽固醇膠束溶解度的抑制效果最好，達(dá)到95%、93%和100%?？喙咸崛∥飳Ζ?葡萄糖苷酶的抑制效果最好為87%。槲皮素對膽固醇酯酶的抑制效果最好，為92%。丹皮酚和枸杞多糖雖然對α-葡萄糖苷酶抑制效果較好，但是與前幾種功能因子相比，其對膽固醇膠束溶解度、α-淀粉酶、胰脂肪酶酶，膽固醇酯酶的效果比較弱。所以根據(jù)以上研究結(jié)果，EGCG、絞股藍(lán)皂甙、槲皮素、牡丹籽油和苦瓜提取物對胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶和膽固醇膠束溶解度抑制效果較好。因為茶多酚和銀杏黃酮分別含EGCG和槲皮素比較多，所以最后確定茶多酚、銀杏黃酮、絞股藍(lán)皂甙、牡丹籽油和苦瓜提取物作為復(fù)方的功能性成分。

2.2 功能因子對消化酶和膽固醇膠束溶解度的抑制率

圖2比較了5種功能因子對胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度的IC50值。由圖2可以看出，與其他4種成分相比，茶多酚對胰脂肪酶，α-淀粉酶和膽固醇膠束溶解度的抑制效果明顯強(qiáng)于其他4種成分，其IC50值分別是0.45、0.42和0.15 mg/mL低于其他4種成分，且茶多酚對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果強(qiáng)于荷葉黃酮 （2.20 mg/mL，1.86 mg/mL）[18]；茶多酚對胰脂肪酶活性的抑制效果優(yōu)于刺五加皂甙（0.75 mg/mL）[19]。但是茶多酚對膽固醇酯酶的抑制效果最弱?？喙咸崛∥飳Ζ?葡萄糖苷酶的抑制效果最好，其IC50值為0.41 mg/ml，圓葉葡萄甲醇提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制IC50值為1.50 mg/mL[20]。銀杏黃酮對膽固醇酯酶的抑制效果最好，其IC50值為0.26 mg/mL低于已報道的苦瓜水提物對膽固醇酯酶的抑制效果[21]。

圖 2 5種功能因子對胰脂肪酶，α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶和膽固醇膠束溶解度的IC50Fig.2 IC50value of pancreatic lipase，α -amylase，α -glucosidase，cholesterol eaterase and cholesterol micelle solubility by 5 functional factors

2.3 正交t值法-主藥分析

結(jié)果顯示，茶多酚、牡丹籽油和銀杏黃酮對α-淀粉酶和膽固醇酯酶活性加權(quán)綜合抑制效果作用顯著，因此茶多酚、牡丹籽油和銀杏黃酮是復(fù)方主藥成分。絞股藍(lán)皂甙和苦瓜提取物可能為輔藥。

2.4 正交t值輔藥交互作用分析

用正交表著重分析輔藥彼此間的交互作用，A（茶多酚、牡丹籽油和銀杏黃酮）、B（絞股藍(lán)皂甙）、C（苦瓜提取物）質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，按照圖2 IC50的比例設(shè)置濃度配比。

由表8可以看出，絞股藍(lán)皂甙和苦瓜提取物與復(fù)方主要成分可以協(xié)同性抑制膽固醇酯酶和α-淀粉酶活性。

2.5 D值優(yōu)化法復(fù)方功能性成分配比

各因素確定后，篩選出來的功能因子每種為一個因素，隨機(jī)選定為A、B、C、D、E等。每個因素設(shè)3個水平，從胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度5個評價指標(biāo)中任意選取3個。以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和膽固醇酯酶的IC50值為水平劑量依據(jù)，在此基礎(chǔ)上適當(dāng)增減（如表5）?？傎|(zhì)量濃度是0.5 mg/mL，根據(jù)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和膽固醇酯酶活性抑制率，用D值優(yōu)化法進(jìn)行劑量優(yōu)化分析。

表2 主藥分析的實驗結(jié)果Table 2 Result of primary medicine analysis

表3 因素及水平Table 3 Factors and level

表4 正交t值法分析輔藥交互作用（n=3）Table 4 Analysis of adjuvant interaction by orthogonal t value design

表5 因素及水平Table 5 Factors and level

圖3 D值法優(yōu)化實驗數(shù)據(jù)處理結(jié)果Fig.3 Analysis table of dose optimization by D value optimization

由復(fù)方對3種酶的抑制效果可以看出，A3質(zhì)量濃度（苦瓜提取物）時，復(fù)方對膽固醇酯酶，α-葡萄糖苷酶的抑制效果優(yōu)于A1和A2質(zhì)量濃度；B1、B2和B3（銀杏黃酮）3種質(zhì)量濃度的比較可以看出，B3濃度時，復(fù)方對α-淀粉酶和膽固醇酯酶的抑制效果優(yōu)于B1和B2；C2（茶多酚）時，復(fù)方對膽固醇酯酶和α-葡萄糖苷酶的抑制效果優(yōu)于C1和C3；D1（絞股藍(lán)皂甙）時，復(fù)方對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和膽固醇酯酶的抑制效果優(yōu)于D2和D3，E2（牡丹籽油）時，復(fù)方對膽固醇酯酶和α-淀粉酶的抑制效果優(yōu)于E1和E1。因此，根據(jù)復(fù)方5種功能因子3個水平對3種消化酶活性的抑制效果可以看出A3、B3、C2、D1和E2是復(fù)方的最佳質(zhì)量濃度， 最佳劑量配比為A3∶B3∶C2∶D1∶E2=m（苦瓜提取物）∶m（銀杏黃酮）∶m（茶多酚）∶m（絞股藍(lán)皂甙）∶m（牡丹籽油）=8∶8∶6∶5∶8。 復(fù)方對 α-淀粉酶、α-葡萄糖糖苷酶和膽固醇酯酶的IC50值分別為0.40、0.38 和 0.32 mg/mL。

3 結(jié) 語

首先比較了9種功能因子對膽固醇酯酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶和膽固醇膠束溶解度抑制效果，最后確定茶多酚、銀杏黃酮、牡丹籽油、苦瓜提取物及絞股藍(lán)皂甙作為復(fù)方的功能成分，并且計算出IC50值。以功能因子對α-淀粉酶和膽固醇酯酶活性抑制效果IC50為依據(jù)，對茶多酚、銀杏黃酮、牡丹籽油、苦瓜提取物及絞股藍(lán)皂甙5種成分進(jìn)行主藥分析及輔藥交互作用分析。正交t值法源于正交設(shè)計，適合多味藥的復(fù)方研究，可以用較少的試驗次數(shù)分析較多的因素，找出各因素的主次地位及交互作用。D-優(yōu)化實驗設(shè)計在總量不變的基礎(chǔ)上用較少的實驗設(shè)計實現(xiàn)多目標(biāo)同步優(yōu)化。作者結(jié)合了正交t值和D-優(yōu)化實驗的優(yōu)點，正交t值法進(jìn)行了主藥分析和輔藥交互作用分析，用D-優(yōu)化實驗實現(xiàn)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶多目標(biāo)同步優(yōu)化，確定了最優(yōu)劑量配比（IC50值分別是 0.40、0.38、0.32 mg/mL），其對消化酶活性的抑制效果強(qiáng)于已報到的植物提取物荷葉黃酮、刺五加皂甙、圓葉葡萄甲醇提取物及苦瓜水提物[18-20]。

目前已有大量文獻(xiàn)報道了功能因子對胰脂肪酶、α-淀粉酶[22]、α-葡萄糖苷酶[23]、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度抑制效果[24]。茶多酚對膽固醇膠束溶解度、胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和膽固醇酯酶抑制效果的研究已有報道[25]。目前還沒有研究發(fā)現(xiàn)銀杏黃酮對胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶和膽固醇膠束溶解度的作用效果，但是Liu研究了荷葉黃酮對胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制效果[18]，其IC50值分別是0.38、2.20和1.38 mg/mL，本研究中銀杏黃酮對其的IC50值分別是1.21、0.76和0.51 mg/mL。雖然荷葉黃酮對胰脂肪酶的抑制效果優(yōu)于銀杏黃酮，但是銀杏黃酮對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制效果優(yōu)于荷葉黃酮。Hassan和Cheng研究了銀杏提取物（銀杏黃酮24%）體內(nèi)降血糖效果，與未經(jīng)處理的糖尿病小鼠相比，銀杏提取物顯著性降低了糖尿病小鼠的血糖水平 （p＜0.05）。磷酸化黃酮對膽固醇酯酶的抑制效果已被研究，其IC50值從納摩爾級到微摩爾級，但是也有一些沒有表現(xiàn)出抑制效果[26]。這些合成的抑制子不同的抑制活性歸因于構(gòu)效關(guān)系。然而實驗中銀杏黃酮或者配方對膽固醇酯酶活性抑制的IC50值分別是 0.26和 0.32 mg/mL（圖 2），雖然合成的納摩爾級的抑制子有更好的抑制效果，但是在食品工業(yè)中使用天然產(chǎn)物代替合成抑制子是一種發(fā)展趨勢。Liu研究了人參皂甙[27]對胰脂肪酶的抑制效果，人參皂甙0.5 mg/mL對胰脂肪酶的抑制率為10.1%，且動物實驗也表明了體外酶抑制實驗和體內(nèi)動物降血脂實驗的相關(guān)性，配方中的茶多酚對胰脂肪酶抑制率IC50值為0.45 mg/mL，絞股藍(lán)皂甙對胰脂肪酶抑制率IC50值為0.58 mg/mL，茶多酚和絞股藍(lán)皂甙對胰脂肪酶的抑制效果優(yōu)于人參皂甙。Lee研究了桔梗皂甙對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，桔梗皂甙1 mg/mL對α-葡萄糖苷酶活性抑制率為35%，本研究的配方對α-葡萄糖苷酶的IC50值為0.38 mg/mL，配方的抑制效果優(yōu)于桔梗皂甙[28]。Santoscoy研究了黑豆皂甙和黃酮對膽固醇膠束溶解度的抑制效果，黑豆皂甙5 mg/mL時對膽固醇膠束抑制率為55.4%[29]，本研究配方的5種成分對膽固醇膠束溶解度抑制率IC50＜3.0 mg/mL。Su研究報道了油酸、亞油酸和α-亞麻酸對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制活性，研究發(fā)現(xiàn)油酸、亞油酸和α-亞麻酸對α-葡萄糖苷酶活性抑制率IC50值分別是0.022、0.033 和 0.044 mg/mL[30]，對 α-淀粉酶活性抑制率均大于1 mg/mL，在本實驗中牡丹籽油對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率分別是1.21和0.61 mg/mL，配方對其的抑制率分別是0.40和0.38 mg/mL，由此可見配方中的牡丹籽油可以和其他四種成分協(xié)同性抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性。從以上報道可以看出，配方5種成分可以有效地降低胰脂肪酶、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、膽固醇酯酶活性和膽固醇膠束溶解度，并且目前沒有研究這5種成分的協(xié)同效應(yīng)的報道，作者通過正交t值或D優(yōu)化法優(yōu)化組合了5種功能因子的劑量，結(jié)果表明功能因子復(fù)方體外有效地降低小腸消化酶及膽固醇膠束溶解度，且抑制效果優(yōu)于單一成分。