呂珍珍， 鄔應(yīng)龍， 何 梅， 嚴(yán)秋萍， 陳明睿， 馮莉梅， 趙嘉琪， 王冰瑩

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

葡甘露聚糖廣泛存在于魔芋中，是一種不可消化的可溶性膳食纖維，但魔芋葡甘露聚糖在水中粘度大、溶解度低、流動(dòng)性和溶膠穩(wěn)定性差，使其應(yīng)用受到限制。目前主要采用酶法、物理和酶酸結(jié)合的方法對(duì)葡甘露聚糖進(jìn)行降解，提高其在水中的溶解度，擴(kuò)大葡甘露聚糖的應(yīng)用范圍[1]。

齊口裂腹魚(yú)是中國(guó)特有的重要冷水性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，肉質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高。魚(yú)類營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝及腹腔脂肪過(guò)度蓄積的情況極易發(fā)生，這不僅會(huì)妨礙魚(yú)類的生長(zhǎng)，甚至還可能引發(fā)魚(yú)類疾病，增加養(yǎng)殖成本[2]。對(duì)齊口裂腹魚(yú)脂質(zhì)代謝方面的研究，主要集中在養(yǎng)殖中攝食蛋白質(zhì)及脂肪含量等對(duì)魚(yú)肉品質(zhì)及脂質(zhì)代謝影響，有關(guān)不同改性魔芋葡甘露聚糖對(duì)齊口裂腹魚(yú)脂質(zhì)代謝影響研究較少。

作者分別參考張遼[3]、高松[4]方法制備較低相對(duì)分子質(zhì)量的酸解氧化魔芋和魔芋葡甘露聚糖硫酸酯，探討在飼料中添加不同劑量?jī)煞N不同改性方式的魔芋葡甘露聚糖對(duì)齊口裂腹魚(yú)生長(zhǎng)、血液、基因等脂質(zhì)代謝方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧化魔芋葡甘露聚糖（OKGM）：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院功能性食品實(shí)驗(yàn)室提供。

高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；瓊脂糖：Sigma公司產(chǎn)品；Golden view 染料、2×Taq PCR Master Mix、DEPC-H2O、Loading Buffer、 DL 2000 Marker：天根（Tian gen）試劑公司產(chǎn)品；SYBR 熒光定量試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒均、RNA提取Trizol：Vazyme試劑公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

Bio-Rad實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、Bio-Rad C1000普通 PCR儀、Bio-Rad電泳儀、Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀 （多功能酶標(biāo)儀）、微量移液槍、ThermoFisher高速低溫離心機(jī)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從雅安市天全縣魚(yú)泉鄉(xiāng)購(gòu)得420尾平均魚(yú)體質(zhì)量為（80±1.21）g齊口裂腹魚(yú)，購(gòu)買后于作者所在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)15 d。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

馴養(yǎng)結(jié)束后，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為7個(gè)組（每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20尾），分別為對(duì)照組（基礎(chǔ)飼料）、質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.4%OKGMS、0.8%OKGMS、1.6%OKGMS、0.4%AOKGM、0.8%AOKGM 和 1.6%AOKGM。每天按每缸體質(zhì)量2%投喂飼料，每日3次；早、晚對(duì)魚(yú)缸進(jìn)行換水，并清除缸內(nèi)不溶物。飼養(yǎng)期60 d（12 h白晝，12 h夜晚），24 h不間斷充氧，保持微流水。

1.5 生長(zhǎng)性能指標(biāo)測(cè)定

飼養(yǎng)60 d后，魚(yú)體饑餓24 h，從每缸中選取5尾魚(yú)稱量魚(yú)體質(zhì)量，解剖后取出肝胰臟、背肌及腸道脂肪的質(zhì)量，用預(yù)冷的無(wú)菌生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，置于-20℃冰箱，備用。測(cè)定魚(yú)的肥滿度，肝體比和腸脂比。

1.6 肌肉、肝臟基礎(chǔ)成分的測(cè)定

肝臟基礎(chǔ)成分測(cè)定參照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3-2010 《食品中水分的測(cè)定》105℃直接干燥法、GB/T 5009.6-2003《食品中脂肪的測(cè)定》索氏抽提法、GB 5009.5-2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定。

1.7 樣品的采集和制備

稱重后，尾靜脈取血。將每尾魚(yú)的血液，4℃條件下靜置30 min待血液凝固后，于4℃條件下以3 000 g/min離心15 min，分離血清以用于血清中高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、總膽固醇、及甘油三酯的測(cè)定。測(cè)定方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。

每缸另取5尾魚(yú)取血后，解剖魚(yú)體，分別迅速取出肝胰臟，迅速置于液氮中冷凍，再轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存，用于RNA提取。

1.8 肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因定量分析

1.8.1 RNA提取 肝臟中RNA提取及純化參照TaKaRa試劑盒方法進(jìn)行。

1.8.2 后續(xù)實(shí)驗(yàn)為RT-PCR的cDNA合成 參照HiScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

將產(chǎn)物cDNA稀釋10倍保存于-20℃冰箱，用于后續(xù)熒光定量PCR反應(yīng)。

1.8.3 脂質(zhì)代謝相關(guān)引物 參照鄭俏然[4]等設(shè)計(jì)的齊口裂腹魚(yú)脂質(zhì)代謝相關(guān)引物 β-actin，fas，lpl，hl，選用β-actin作為齊口裂腹魚(yú)內(nèi)參基因 （引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表 1）。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列Table 1 Real-time quantitative PCR primer sequence

1.8.4 熒光定量PCR 參考Tian等[5]已報(bào)道的方法稍作修改，每個(gè)樣品3個(gè)平行。采用SYBR Green I熒光染料法，對(duì) β-actin，fas，lpl，hl引物進(jìn)行熒光定量分析：10 μL反應(yīng)體系，含 5 μL SYBR? Premix Ex TaqTM （2×）、cDNA 1 μL、 上下游引物各 0.25 μL、DEPC 水 3.50 μL。 反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃10 s，相應(yīng)退火溫度 30 s，39個(gè)循環(huán)后，進(jìn)行95℃處理10 s；擴(kuò)增完畢后，迅速降溫到65℃進(jìn)行溶解曲線分析，然后以0.5℃/s的速率從65℃升溫到95℃，連續(xù)測(cè)定樣品熒光強(qiáng)度以獲取溶解曲線。

參考Livak等[6]數(shù)據(jù)分析方法：比較對(duì)照組和基礎(chǔ)組樣本數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCT相關(guān)定量進(jìn)行計(jì)算。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用 Duncan’s檢驗(yàn)法（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 OKGMS及AOKGM對(duì)齊口裂腹魚(yú)基礎(chǔ)生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

與基礎(chǔ)相比，OKGMS及AOKGM各添加劑量對(duì)魚(yú)體體重、肥滿度均無(wú)顯著影響，當(dāng)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%AOKGM時(shí)，顯著增加魚(yú)體的肝體比與腸脂比。

2.2 OKGMS及AOKGM對(duì)齊口裂腹魚(yú)肝臟基礎(chǔ)成分及血清生化指標(biāo)的影響

與基礎(chǔ)組相比，在OKGMS改性條件下，肝臟脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)均有所降低，其中質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%OKGMS差異顯著；血清T-CHO質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著降低；血清HDL-C、TG含量均有所增加，其中0.4%OKGMS及0.8%OKGMS差異顯著。與基礎(chǔ)組相比，在AOKGM改性條件下，肝臟水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所降低，其中0.4%AOKGM及0.8%AOKGM差異顯著；肝臟脂肪、血清T-CHO均顯著降低；0.8%AOKGM及1.6%AOKGM顯著增加血清HDL-C及顯著降低血清TG質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.3 OKGMS及AOKGM對(duì)肝臟相關(guān)基因q-PCR的影響

2.3.1 齊口裂腹魚(yú)lpl，hl，fasPCR擴(kuò)增結(jié)果 以反轉(zhuǎn)錄肝臟cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過(guò)1 g/dL瓊脂糖凝膠檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，分別得到fas145 bp，lpl166 bp，hl268 bp目的產(chǎn)物，且條帶清晰明亮，滿足PCR分析要求。

圖1 齊口裂腹魚(yú)肝臟fas，lpl，hl pcr擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of fas，lpl，hl of Schizothorax prenanti

2.3.2 OKGMS 及 AOKGM 對(duì)肝臟lpl，hl，fas熒光定量的影響lplmRNA在肝臟中相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖2。與基礎(chǔ)組相比，不同劑量OKGMS、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%AOKGM及1.6%AOKGM組肝臟中l(wèi)plmRNA表達(dá)顯著增加，0.8%AOKGM組增加2.7倍。

圖2 lpl mRNA在肝臟中熒光定量PCR相對(duì)表達(dá)Fig.2 lpl mRNA Real-time quantitative PCR relative expression in the liver

hlmRNA在肝臟中相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖3。與基礎(chǔ)組相比，不同劑量OKGMS及AOKGM，hlmRNA相對(duì)表達(dá)量沒(méi)有顯著差異。

圖3 hl mRNA在肝臟中熒光定量PCR相對(duì)表達(dá)Fig.3 hl mRNA Real-time quantitative PCR relative expression in the liver

fasmRNA在肝臟中相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖4。與基礎(chǔ)組相比，1.6%AOKGM顯著增加了肝臟中fasmRNA相對(duì)表達(dá)量，其他各組沒(méi)有顯著差異。

圖4 fas mRNA在肝臟中熒光定量PCR相對(duì)表達(dá)Fig.4 fas mRNA Real-time quantitative PCR relative expression in the liver

3 討 論

肝臟是魚(yú)體脂類代謝的重要器官[7]，在魚(yú)體脂類消化、吸收、合成、分解等過(guò)程中起重要作用。

在陸地生物中發(fā)現(xiàn)，供給甘露寡糖（MOS）影響膽汁酸排泄、食糜上清液粘度或微生物方面變化影響腸脂質(zhì)吸收，進(jìn)而影響游離脂肪酸進(jìn)入肝臟進(jìn)行消耗[8]。然而在魚(yú)體方面，膳食纖維對(duì)脂質(zhì)消化吸收的機(jī)制還不太清楚。肥滿度、肝體比、腸脂比反應(yīng)魚(yú)體脂肪含量，過(guò)多脂肪在魚(yú)肉、肝胰臟及腸系膜等處積累，不僅造成魚(yú)肉品質(zhì)差，魚(yú)體利用率下降影響魚(yú)體品質(zhì)，且易形成脂肪肝造成病害。添加一定劑量OKGMS及AOKGM不會(huì)影響齊口裂腹魚(yú)生長(zhǎng)效果，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%AOKGM顯著增加齊口裂腹魚(yú)肝體比、腸脂比。這與Mansour等[9]證實(shí)巨鱘魚(yú)攝食質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%active MOS 46 d脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，而攝食質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%Immunoster 8周脂質(zhì)不變結(jié)果一致。然而Ye JD等[10]研究證實(shí)牙鲆魚(yú)攝食質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%Bio-MOS 56 d，降低了脂質(zhì)沉積。這表明膳食纖維種類、飼喂時(shí)間、添加劑量等可能影響魚(yú)體脂質(zhì)消化與生長(zhǎng)。

在魚(yú)類脂肪合成和沉積過(guò)程中，lpl，hl，fas等發(fā)揮著重要作用。lpl和hl是調(diào)節(jié)機(jī)體脂肪沉積和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵因子，fas是脂肪合成的關(guān)鍵酶，所以研究lpl，hl，fas基因表達(dá)量對(duì)研究魚(yú)類脂肪代謝至關(guān)重要[11]。脂肪合成分為兩個(gè)部分，第一部分：乙酰輔酶-A羧化酶通過(guò)碳酸氫鹽和ATP催化羧化乙酰輔酶-A形成丙二酰輔酶-A；第二部分：脂肪酸合成酶在NADPH條件下催化縮合乙酰輔酶-A和C2結(jié)構(gòu)形成丙酰輔酶A，然后形成棕櫚酸[12]。fas在脂肪酸的從頭合成中發(fā)揮重要作用，它能催化乙酰輔-A和丙二酸單酰輔酶-A合成長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸，對(duì)動(dòng)物脂肪沉積有著重要意義。OKGMS及AOKGM增加了肝臟中l(wèi)plmRNA表達(dá)，當(dāng)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%AOKGM fas表達(dá)顯著增加。Yokota等[13]證實(shí)了巖藻多糖對(duì)lpl基因表達(dá)的影響，其結(jié)果指出巖藻多糖能誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞lpl基因表達(dá)，且其表達(dá)量隨著巖藻多糖劑量增多及作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加。目前關(guān)于多糖對(duì)水生動(dòng)物hl，fas基因表達(dá)的影響研究還很少。夏曉杰等[7]證實(shí)大中小魚(yú)中l(wèi)pl與fas表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系，對(duì)肌間脂肪沉積有積極作用而hl作用不大。這表明OKGMS及AOKGM調(diào)控了lpl表達(dá)，在一定范圍內(nèi)影響fas表達(dá)，且隨著膳食纖維種類及添加劑量不同表達(dá)不同。

脂肪在魚(yú)類細(xì)胞內(nèi)主要以甘油三酯形式存在，甘油三酯是魚(yú)類脂類代謝的主要產(chǎn)物[14]。血漿中甘油三酯的含量是通過(guò)極低密度脂蛋白和乳糜微粒顆粒的合成與分解來(lái)調(diào)控。血液循環(huán)中是通過(guò)lpl和hl作用以及利用膽固醇酯酶轉(zhuǎn)移蛋白使內(nèi)脂蛋白與甘油三酯進(jìn)行置換來(lái)清除富含甘油三酯的脂蛋白[15]。OKGMS能顯著降低肝臟脂肪及血清膽固醇含量，增加血清高密度脂蛋白含量，當(dāng)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%OKGMS效果明顯；AOKGM顯著降低肝臟水分、脂肪及血清膽固醇、甘油三酯含量，增加血清高密度脂蛋白含量，當(dāng)添加劑量為0.8%AOKGM效果明顯。與Fiordaliso等[15]研究低聚木糖和低聚果糖減少了肝臟脂肪生成，血液和肝臟膽固醇和甘油三酯水平，增加了血液中HDL/LDL比率結(jié)果一致。Lahoz等[16]證實(shí)在哺乳動(dòng)物中hl作為高密度脂蛋白配體是一種脂肪分解酶，促進(jìn)肝臟對(duì)它吸收。而且魚(yú)體中l(wèi)pl和hl促進(jìn)了肝臟對(duì)脂蛋白吸收，所以魚(yú)血清中高密度脂蛋白水平比其他脊椎動(dòng)物高幾倍。Tian[5]等證實(shí)lpl表達(dá)增加，血清中高密度脂蛋白含量增加，甘油三酯含量降低。Delzenne等[17]證實(shí)較低肝臟脂肪可能與攝食中低聚木糖通過(guò)魚(yú)腸道微生物菌群發(fā)酵，生成葡萄糖激酶與結(jié)腸中短鏈脂肪酸。因此Campbell等[18]證實(shí)老鼠飲食中含有低聚木糖增加了盲腸中短鏈脂肪酸即醋酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽和乳酸鹽濃度。然而主要短鏈脂肪酸產(chǎn)物醋酸鹽和丙酸鹽對(duì)脂質(zhì)代謝調(diào)制是相反的。醋酸鹽是脂肪生成的基質(zhì)，丙酸鹽競(jìng)爭(zhēng)性抑制醋酸鹽進(jìn)入肝臟細(xì)胞。益生元被腸道微生物發(fā)酵的模式和肝臟醋酸鹽與丙酸鹽比例將決定其低脂肪性能，同時(shí)醋酸鹽與丙酸鹽比例因魚(yú)種類的不同而改變。由此推測(cè)添加一定劑量OKGMS或AOKGM，可能會(huì)增加食物體積，稀釋腸道內(nèi)容物，促進(jìn)有益菌乳酸菌、雙歧桿菌生長(zhǎng)，產(chǎn)生短鏈脂肪酸并提高腸道短鏈脂肪酸濃度及比例，調(diào)控齊口裂腹魚(yú)肝臟中l(wèi)pl表達(dá)，影響肝臟脂蛋白酯酶的活性，增加高密度脂蛋白含量促進(jìn)高密度脂蛋白反向運(yùn)輸膽固醇進(jìn)入肝臟，加速膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝，降低肝臟脂肪、血液中膽固醇和甘油三酯含量，增加高密度脂蛋白含量，調(diào)節(jié)魚(yú)體脂質(zhì)代謝。

4 結(jié) 語(yǔ)

對(duì)比了兩種改性魔芋葡甘露聚糖對(duì)齊口裂腹魚(yú)脂質(zhì)代謝及肝臟相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在OKGMS改性條件下，不同添加劑量降低齊口裂腹魚(yú)肝臟脂肪及血清膽固醇含量，顯著增加血清高密脂蛋白含量及肝臟lpl表達(dá)，且添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%效果更好。在AOKGM改性條件下不同添加劑量降低肝臟脂肪；對(duì)血清膽固醇、甘油三脂含量呈先降低后增加趨勢(shì)；增加血清高密脂蛋白含量及肝臟lpl表達(dá)，且添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%效果更好。