陳晨 王添敏 邸學(xué) 康廷國

【摘 要】 目的：對(duì)大鼠口服胡桃楸水提取物后血漿中沒食子酸和丁香酸進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，初步確定其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。方法：采用HPLC分析方法測(cè)定大鼠血漿中沒食子酸和丁香酸的濃度。色譜柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×100 mm，2.7 μm），預(yù)柱：Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×5 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相：0.2%甲酸水（v/v，A）- 0.2%甲酸乙腈（v/v，B），流速：0.3 mL/min，梯度洗脫條件為：0～3 min，0～5 % B；3～5 min，5～10 % B；5～13 min，10 % B，后運(yùn)行時(shí)間為3 min，柱溫為30 ℃。單次灌胃給予大鼠胡桃楸水提取物（以生藥量計(jì)9.6 g/mL），灌胃劑量為1 mL/100 g，于給藥前和給藥后5、15、30、45、60、90、120、240、360和480 min分別取血0.2 mL，將血漿采用甲醇蛋白沉淀法處理后，取10 μL供HPLC分析。應(yīng)用3P97軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果：沒食子酸在0.04～5 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，最小檢測(cè)限（LOQ）為0.006 μg/mL，最小定量限（LOD）為0.04 μg/mL；日內(nèi)和日間精密度（RSD）分別為1.8 %～11.0 %和3.5 %～9.4 %，準(zhǔn)確度（RE）分別為-0.7 %～1.3 %和-0.5 %～2.1 %；血漿提取回收率為81.2 %～94.4 %；藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為Cmax=（0.64±0.05）μg/mL，Tmax=（61.80±8.03）min，T1/2=（184.21±12.73）min，AUC0-t=（96.37±10.33）μg·min/mL，AUC0-∞=（121.59±8.87）μg·min/mL。丁香酸在0.04～5 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，最小檢測(cè)限（LOQ）為0.008 μg/mL，最小定量限（LOD）為0.04 μg/mL；日內(nèi)和日間精密度（RSD）分別為4.0 %～6.9 %和2.1 %～8.8 %，準(zhǔn)確度（RE）分別為-1.2 %～4.9 %和-4.8 %～0.8 %；血漿提取回收率為84.9 %～93.6 %；藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)為Cmax=（0.43±0.04）μg/mL，Tmax=（30.67±0.92）min，T1/2=（99.63±5.96）min，AUC0-t=（40.33±2.42）μg·min/mL，AUC0-∞ =（47.02±3.29）μg·min/mL。結(jié)論：研究建立大鼠血漿中沒食子酸和丁香酸濃度的高效液相色譜分析方法，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，符合生物樣品分析的要求，并成功應(yīng)用于大鼠血漿中沒食子酸和丁香酸的分析。

【關(guān)鍵詞】 胡桃楸；沒食子酸；丁香酸；大鼠；藥代動(dòng)力學(xué)

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2018）04-0028-06

Abstract：Objective Made a pharmacokinetic research of gallic acid and syringic acid in rat plasma after orally administration of the water extraction of Juglans mandshurica Maxim. to preliminary confirm parameters of pharmacokinetics. Methods Used a HPLC analytical method to test concentrations of gallic acid and syringic acid in rat plasma. Column： Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×100 mm， 2.7 μm）and Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×5 mm， 2.7 μm）； mobile phases consist of ultra pure water （A） and acetonitrile （B） both with 0.2 % （v/v） formic acid at a flow rate of 0.3 mL/min， the following gradient elution was applied： from 0 % to 5 % B between 0 and 3 min， from 5 % to 10 % B between 3 and 5 min， 10 % B between 5 and 13 min， a 3 min post run time back to the initial mobile phase composition was used after each injection， column temperature was set at 30 ℃.Blood samples （0.2 mL） were collected before dosing and 5， 15， 30， 45， 60， 90， 120， 240， 360， 480 min after single dosing （crude herbal： 9.6 g/mL）， the dose of intragastric administration was 1 mL/100 g. After pre-treatment with protein precipitation method （methyl）， 10 μL was injected into HPLC system. The pharmacokinetic parameters were calculated by 3p97. Results Gallic acid had great linear at the range of 0.04～5 μg/mL， LOQ = 0.006 μg/mL， LOD = 0.04 μg/mL； the RSDs of precision were from 1.8 % to 11.0 % for inter-day assay and from 3.5 % to 9.4 % for intra-day. The accuracy were at the range of -0.7 %～1.3 % and -0.5 %～2.1 %， respectively； the extraction recoveries were from 81.2 % to 94.4 %； Cmax and Tmax were （0.64±0.05 μ）g/mL and （61.8±8.03）min， T1/2 were （184.21±12.73）min， AUC0-t and AUC0-∞ were （96.37±10.33）μg·min/mL and （121.59±8.87）μg@min/mL. Springic acid had great linear at the range of 0.04～5 μg/mL， LOQ = 0.008 μg/mL， LOD = 0.04 μg/mL； the RSDs of precision were from 4.0 to 6.9 % for inter-day assay and from 2.1 % to 8.8 % for intra-day. The accuracy were at the range of -1.2 %～4.9 % and -4.8 %～0.8 %， respectively； the extraction recoveries were from 84.9 % to 93.6 % ； Cmax and Tmax were （0.43±0.04）μg/mL and （30.67±0.92）min， T1/2 were （184.21±14.73）min， AUC0-t and AUC0-∞ were （40.33±2.42）μg·min/mL and （47.02±3.29）μg·min/mL. Conclusion The described HPLC method， with acceptable accuracy， which met all requirements in bioanalysis and was applied to analyze gallic acid and syringic acid in rat plasma successfully.

Keywords：Juglans mandshurica Maxim.； Gallic acid； Syringic acid； Rat； Pharmacokinetics

胡桃楸又名山核桃、核桃楸，為胡桃科胡桃屬植物Juglans mandshurica Maxim.，分布于我國東北、華北以及朝鮮、日本等地區(qū)[1-2]。胡桃楸與同屬植物胡桃（J. regic L.）功效類似，胡桃始載于宋代《開寶本草》，具有鎮(zhèn)痛、清熱解毒之功效。研究表明，胡桃楸具有防護(hù)電離輻射[3]、抗氧化[4]和抗腫瘤[5]等藥理作用。據(jù)WHO預(yù)測(cè)，全球癌癥病例到2035年將達(dá)到2400萬人[6]，癌癥已經(jīng)成為威脅人類健康的重要因素。如何有效控制、治療癌癥受到全世界的關(guān)注。胡桃楸的水煎液在民間即用于治療肝癌和胃癌[7-8]等。目前，越來越多的學(xué)者關(guān)注胡桃楸的抗腫瘤作用，據(jù)報(bào)道胡桃楸莖枝和樹皮等均具有抗腫瘤的作用[9-10]。本課題組研究表明胡桃楸不同部位的水提取和乙醇提取物具有一定的抗腫瘤作用[11-12]。由于胡桃楸抗腫瘤功效較好，關(guān)于其研究越來越多，研究方向多集中在化學(xué)成分分析[13-14]和體外抗腫瘤活性研究（Hela、PC-3、SMMC-7721、MCF-7和A549）[15-16]等方面。關(guān)于胡桃楸水提取物的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。筆者應(yīng)用HPLC 分析方法研究胡桃楸水提取物中主要成分沒食子酸和丁香酸在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為胡桃楸的深入研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 試劑與材料 胡桃楸莖枝于2016年4月6日在遼寧省大連市普蘭店蓮山鎮(zhèn)采摘，并由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)翟延君教授鑒定為胡桃科植物胡桃楸（Juglans mandshurica Maxim.），憑證標(biāo)本編號(hào)為ZHI20160406，保存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定研究室。沒食子酸（Gallic acid）、丁香酸（Syringic acid）和咖啡酸（Caffeic acid）均購于Sigma-Aldrich （上海），純度均>98 %；乙腈購于默克公司（達(dá)姆施塔特，德國）；維生素C、甲醇購買于科密歐化學(xué)試劑有限公司（天津）；純凈水購于大連娃哈哈飲用水有限公司（大連，遼寧）。乙腈和甲醇均為色譜級(jí)試劑，甲醇和純凈水在使用前均經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜濾過。

1.2 儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；QF-3800氮?dú)獯蹈蓛x（天津市旗美科技有限公司）；H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DIII循環(huán)水真空泵（河南予華儀器有限責(zé)任公司；JA21002精密電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；ALC-110.4電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；CP225D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重為（200±20）g，購于遼寧長生生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK（遼）2015-0003。

2 方法

2.1 胡桃楸水提取物的制備 將胡桃楸莖枝切成厚度為5 mm的飲片，冷凍干燥；稱取200 g凍干飲片，置于5000 mL圓底燒瓶中，加入2000 mL純凈水，浸泡2 h，回流提取2 h，濾過，殘?jiān)眠m量純凈水潤洗后，繼續(xù)加入1600 mL純凈水回流提取2次，每次2 h。合并所有水提取液和潤洗液，濾過，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（60℃）減壓濃縮至50 mL。濃縮液冷凍干燥48 h（-50 ℃，10 pa），得胡桃楸水提取物凍干粉25 g。實(shí)驗(yàn)前，稱取凍干粉18 g加入15 mL純凈水，混勻，即為用于大鼠口服給藥的胡桃楸水提取物，以生藥計(jì)濃度為9.6 g/mL。經(jīng)HPLC測(cè)定胡桃楸水提取物中沒食子酸和丁香酸的含量分別為19.38 %和1.05 %。

2.2 色譜條件 采用Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×100 mm，2.7 μm）色譜柱和Agilent Poroshell 120 SB-C18（2.1×5 mm，2.7 μm）預(yù)柱（安捷倫）對(duì)待測(cè)物（沒食子酸、丁香酸）和內(nèi)標(biāo)物（咖啡酸）進(jìn)行梯度洗脫分析。流動(dòng)相為0.2 %甲酸水（A）-0.2 %甲酸乙腈（B），梯度洗脫條件為：0～3 min，0～5 % B；3～5 min，5 %～10 % B；5～13 min，10 % B，后運(yùn)行時(shí)間為3 min，柱溫設(shè)定為30 ℃，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL。

2.3 血漿樣品處理方法 吸取100 μL血漿，分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和10 μL維生素C溶液（5 mg/mL），渦旋1 min，向混合物中加入360 μL甲醇，渦旋1 min，再靜置3 min，以10，000 rpm條件下離心3 min，移取上清液于另一1.5 mL EP管內(nèi)，空氣吹干溶劑，在殘?jiān)屑尤?0 μL 10 %甲醇（v/v）溶液復(fù)溶，渦旋3 min，以10，000 rpm條件下離心3 min，取上清液10 μL供HPLC分析。

2.4 待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液的配制 分別精密稱取沒食子酸、丁香酸和咖啡酸對(duì)照品（圖1）適量，加入10 %甲醇溶液溶解，配置成濃度為1 mg/mL的待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液。

2.5 質(zhì)控（QC）樣品的制備 取空白血漿100 μL，分別加入沒食子酸、丁香酸工作液各10 μL（濃度均為0.5、5和40 μg/mL），制備成低、中和高3個(gè)不同濃度的QC樣品。沒食子酸和丁香酸的血漿濃度均為0.05、0.5和4 μg/mL。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 專屬性 將空白血漿、加入待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的空白血漿、胡桃楸水提取物口服給藥后的血漿，按照“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下的方法處理（重復(fù)6次），對(duì)比上述三者的色譜圖，以排除待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物出峰時(shí)間內(nèi)的干擾峰，考察方法的專屬性。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將沒食子和丁香酸的儲(chǔ)備液用10 %甲醇溶液逐級(jí)稀釋，沒食子酸和丁香酸系列工作液濃度均為0.4、1、2、5、10、20和50 μg/mL；取適量咖啡酸儲(chǔ)備液，用10 %甲醇溶液將濃度稀釋至5 μg/mL，即為內(nèi)標(biāo)溶液。取100 μL 空白血漿，分別加入沒食子酸、丁香酸系列工作液各10 μL，配置成相當(dāng)于沒食子酸和丁香酸的血漿濃度為0.04、0.1、0.2、0.5、1、2和5 μg/mL的血漿樣品，按照“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下的步驟操作后，取10 μL供HPLC分析，以1/C2作為權(quán)重系數(shù)，以相對(duì)峰面積對(duì)血漿濃度進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)。

2.6.3 準(zhǔn)確度、精密度 取低、中和高3個(gè)濃度的QC樣品，按照“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度重復(fù)6次，連續(xù)測(cè)定3 d。根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿濃度，計(jì)算同一濃度QC樣品的RSD和RE，考察方法的日內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度，連續(xù)計(jì)算3 d，考察方法的日間精密度和準(zhǔn)確度。

2.6.4 提取回收率 取低、中和高3個(gè)濃度的QC樣品，按照“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下的方法處理后進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度重復(fù)6次。記錄沒食子酸、丁香酸和咖啡酸的峰面積（A1）；另取空白血漿樣品，除不加內(nèi)標(biāo)溶液，其余按照“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下的方法操作，蛋白沉淀后的上清液中加入上述相應(yīng)等濃度的沒食子酸和丁香酸工作液10 μL、內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，然后同法操作，記錄沒食子酸、丁香酸和咖啡酸的峰面積（A2）。以峰面積的比值A(chǔ)1/ A2計(jì)算提取回收率。

2.6.5 穩(wěn)定性 取低、中和高3個(gè)濃度的QC樣品，按照“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，每個(gè)樣品重復(fù)3次。考察含藥血漿樣品處理后室溫放置3 h、含藥血漿-20℃放置14 d和含藥血漿樣品-20℃至室溫反復(fù)凍融循環(huán)3次的穩(wěn)定性。

2.7 藥代動(dòng)力學(xué)研究 取6只SD大鼠，在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，口服給藥前12 h禁食，自由飲水。胡桃楸水提取物的口服給藥量為12 g/kg（給藥體積為1 mL/100g）， 于給藥前及給藥后5、15、30、45、60、90、120、240、360和480 min眼底靜脈叢取血約0.2 mL，置于肝素化1.5 mL離心管，10，000 rpm離心3 min，上清液即為血漿樣品。另取1.5 mL離心管，加入100 μL血漿樣品，按照“血漿樣品處理方法”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定大鼠血漿中沒食子酸、丁香酸的濃度，使用Excle軟件繪制血漿濃度-時(shí)間曲線，應(yīng)用藥代動(dòng)力學(xué)處理軟件3p97按二室模型計(jì)算主要的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 HPLC分析方法建立和驗(yàn)證

3.1.1 專屬性 比較空白血漿、加入待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物的空白血漿和口服給藥后血漿的色譜圖，如圖2顯示，在沒食子酸（4.21 min）、丁香酸（11.82 min）和咖啡酸（9.66 min）的保留時(shí)間內(nèi)，無雜質(zhì)峰干擾，待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物之間互不干擾。

3.1.2 線性關(guān)系 加入沒食子酸和丁香酸系列工作液的血漿樣品，按照“血漿處理方法”項(xiàng)下步驟處理后，供HPLC分析，以1/C2作為權(quán)重系數(shù)由SPSS軟件擬合出沒食子酸和丁香酸線性回歸曲線方程、相關(guān)系數(shù)以及線性范圍均列于表1。最小定量限為0.04 μg/mL（信噪比為10）。其中，y定義為各待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值，x定義為血漿濃度。

3.1.3 精密度與準(zhǔn)確度 由表2可知，沒食子酸、丁香酸的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度均符合生物分析方法的要求，表明分析方法穩(wěn)定可行。

3.1.4 回收率 由表3可知，沒食子酸和丁香酸低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率均在81.2 %～94.4 %之間，RSD在9.1 %以內(nèi)，因此該血漿處理方法對(duì)2個(gè)待測(cè)物基本適用。

3.1.5 穩(wěn)定性 由表4可知，沒食子酸和丁香酸低、中、高3個(gè)不同濃度QC樣品在室溫放置3 h、冷凍2周和3個(gè)凍融循環(huán)后，待測(cè)物濃度沒有明顯變化，穩(wěn)定性良好。

3.2 大鼠藥動(dòng)學(xué)研究 大鼠口服給藥后，沒食子酸和丁香酸血漿濃度-時(shí)間曲線如圖3所示，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)詳見表5。

4 討論

在血漿樣品處理方法建立過程中，考察了不同提取條件，如：乙腈和甲醇分別作為沉淀劑、乙酸乙酯提取和正丁醇提取，每個(gè)提取方法考察了不同的酸化條件，包括酸的種類、濃度和加入體積。結(jié)果表明，加入10 μL 維生素C溶液（5 mg/mL），以甲醇作為蛋白沉淀劑的提取回收率高，重復(fù)性好，無內(nèi)源性雜質(zhì)干擾。

選擇內(nèi)標(biāo)物時(shí)，應(yīng)主要考慮以下因素：內(nèi)標(biāo)物的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不與內(nèi)源性物質(zhì)和待測(cè)物反應(yīng)；內(nèi)標(biāo)物要與待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似；出峰時(shí)間與待測(cè)物相近。本研究考察了咖啡酸、香草酸和芥子酸，綜合上述標(biāo)準(zhǔn)，最終選擇咖啡酸作為內(nèi)標(biāo)物。

沒食子酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：Cmax=（0.64±0.05）μg/mL，Tmax=（61.80±8.03）min，T1/2=（184.21±12.73）min，AUC0-t=（96.37±10.33）μg·min/mL，AUC0-∞=（121.59±8.87）μg·min/mL；丁香酸的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下：Cmax=（0.43±0.04）μg/mL，Tmax=（30.67±0.92）min，T1/2=（99.63±5.96）min，AUC0-t=（40.33±2.42）μg·min/mL，AUC0-∞=（47.02±3.29）μg·min/mL。以上沒食子酸和丁香酸在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)與已發(fā)表文獻(xiàn)[17-18]中不同，可能是因?yàn)楹议彼崛∥镏衅渌煞謱?duì)其產(chǎn)生影響，需進(jìn)一步研究。

研究表明沒食子酸和丁香酸廣泛存在于胡桃楸的不同部位，并且可以分別抑制人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH [19]和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231[20]等腫瘤細(xì)胞的增長。同時(shí)，胡桃楸不同部位的水提取物和乙醇提取物均具有不同程度的抗腫瘤作用，因此沒食子酸和丁香酸可能是抗腫瘤的活性成分[11-12]。

經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證，此HPLC分析方法適用于分析血漿樣品中沒食子酸和丁香酸的含量，且靈敏度高，重現(xiàn)性好，精密度和準(zhǔn)確度均符合生物樣品分析的要求。胡桃楸水提取物中沒食子酸和丁香酸的藥代動(dòng)力學(xué)研究為胡桃楸的深入研究和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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