陳 浩，石 磊，解繼紅，宋智青

(1.內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010051；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010)

20世紀(jì)80年代中期，余增亮研究員帶領(lǐng)的研究組首先將低能離子注入技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)作物的誘變育種，發(fā)現(xiàn)低能離子注入作為一種新的生物誘變?cè)淳哂袚p傷輕、突變率高、突變譜廣的特點(diǎn)。該技術(shù)關(guān)聯(lián)度高、影響面廣，用于農(nóng)作物和微生物育種取得一系列成果，是一種行之有效的誘變方法[1-4]。與此同時(shí)，低能離子注入的當(dāng)代刺激效應(yīng)也能夠促進(jìn)微生物和植物生長(zhǎng)，這些作用對(duì)于物種的改良都十分重要。然而，關(guān)于低能離子注入對(duì)植物根部微生物影響的研究很少，限制它的應(yīng)用。

叢枝菌根真菌(ArbuscularMycorrhizalfungi，AMF)是一種專性共生真菌，而叢枝菌根(ArbuscularMycorrhiza，AM)是由叢枝菌根真菌與植物形成的共生聯(lián)合體，是地球上分布最廣泛的共生體。叢枝菌根真菌能夠侵染包括豆科牧草在內(nèi)的80%的陸生植物，它能夠從土壤中吸收礦質(zhì)元素，如N、P等，并傳輸給植物促進(jìn)其生長(zhǎng)，同時(shí)也從植物體中吸收碳水化合物和脂類[5-8]。但是，當(dāng)叢枝菌根共生體暴露在土壤中時(shí)，土壤環(huán)境中的負(fù)面因素(如鹽堿、干旱、低溫、污染物等)對(duì)其孢子的萌發(fā)、菌群落的變化、繁殖也有一定的影響，必然會(huì)影響叢枝菌根的形成及功能，進(jìn)而影響叢枝菌根的接種效果。如果能將低能離子束生物技術(shù)應(yīng)用于叢枝菌根真菌的品質(zhì)改良，則可望提高叢枝菌根真菌利用的效果。蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)因與其他重要作物如大豆、紫花苜蓿親緣關(guān)系很近，而且具有其他豆科植物所不具有的遺傳特性而被人們選擇為研究豆科的模式植物[9]。同時(shí)，蒺藜苜?？梢院蛥仓婢纬闪己玫墓采P(guān)系。因此，蒺藜苜蓿是用來(lái)研究叢枝菌根共生的優(yōu)良材料。

選定豆科模式植物——蒺藜苜蓿為宿主，以光自養(yǎng)培養(yǎng)體系共生培養(yǎng)，研究低能離子注入對(duì)叢枝菌根真菌生長(zhǎng)及其與蒺藜苜蓿共生的影響，探討提高蒺藜苜蓿-叢枝菌根共生體系在逆境生存力的方法，為提高豆科牧草抗逆性的研究提供新思路和新方法。

1 材料與方法

1.1供試菌種GlomusetunicatumBecker&Gerdemann由美國(guó)康奈爾大學(xué)Teresa E.Pawlowska 博士饋贈(zèng)。

1.2寄主及培養(yǎng)基蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，ecotype Jemalong A17)由美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)N.D.Young博士饋贈(zèng)。蒺藜苜蓿和叢枝菌根真菌都是在MSR培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(modified Strullu-Romand medium)[10]。MSR培養(yǎng)基成分見(jiàn)表1。

1.3叢枝菌根真菌孢子的無(wú)菌提取當(dāng)AMF新生孢子成熟后，將含有孢子的培養(yǎng)基放入無(wú)菌錐形瓶中，加入10倍體積無(wú)菌的10 mmol/L檸檬酸鈉，并充分?jǐn)嚢柚伶咦雍途z分離。用200目尼龍網(wǎng)過(guò)濾得到孢子，以去除殘留的檸檬酸鈉，再用無(wú)菌水將孢子洗下，在解剖鏡下將孢子用20 μL移液器收集到無(wú)菌的1.5 mL離心管中待用[11]。

表1MSR培養(yǎng)基組分

Table1ThecompositionofmodifiedStrullu-Romand(MSR)mediamg/L

組分Composition含量Content組分Composition含量ContentMgSO4·7H2O739 KCl65 KNO376KH2PO44.1Ca(NO3)2·4H2O359MnSO4·4H2O2.45ZnSO4·7H2O0.29H3BO31.86CuSO4·5H2O0.24Na2Mo O40.002 4(NH4)6Mo7O24·4H2O0.035Thiamin(VB1)1Pyridoxine(VB6)0.9Cyanocobalamine(VB12)0.4Nicotinic acid1泛酸鈣0.9生物素Biotin0.9×10-3NaFe·EDTA8

注：調(diào)節(jié)pH，121℃高壓蒸汽滅菌15 min

Note：Regulating pH，high pressure steam sterilization for 15 min at 121 ℃

1.4低能離子注入注入裝置為低能離子注入機(jī)(IBBe-Device)。注入離子為Ar離子，劑量為0(CK1)，1.25×1015，2.50×1015，3.75×1015，5.00×1015，6.25×1015，7.50×1015ions/cm2，以真空作對(duì)照組(CK2)。能量為30 keV，脈沖注入，每個(gè)脈沖注入1.25×1015ions/cm2，脈沖之間間隔30 s，真空度為0.05 Pa。真空對(duì)照置于注入托盤(pán)上，除了沒(méi)有接受離子注入外，其他條件及后續(xù)處理均與處理組一致。

1.5孢子萌發(fā)率和菌絲長(zhǎng)度檢測(cè)每個(gè)平皿中接入 80～100 個(gè)提取的Glomusetunicatum無(wú)菌孢子。用Parafilm膜封口后，于 28 ℃黑暗倒置培養(yǎng) 10 d。取出置于解剖鏡(Motic K-700 L)下統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，于顯微鏡(Olympus X51)下統(tǒng)計(jì)菌絲長(zhǎng)度，每組處理重復(fù)3次。 相對(duì)菌絲長(zhǎng)度計(jì)算公式如下：

相對(duì)菌絲長(zhǎng)度(%)= 處理組孢子菌絲長(zhǎng)度/對(duì)照組孢子菌絲長(zhǎng)度×100%

(1)

1.6光自養(yǎng)培養(yǎng)體系和侵染率的檢測(cè)光自養(yǎng)培養(yǎng)體系裝置分2個(gè)部分：苗室和菌根室。菌根室中加入約40 mL MSR培養(yǎng)基(用0.3%Phytogel固定，不含蔗糖和維生素)。將萌發(fā)3 d的幼苗移入菌根室，并將幼苗頂端插入苗室底部與菌根室相連的孔中，然后將約20粒上述方法得到的孢子加入到幼苗根旁，用封口膜將培養(yǎng)皿封住。將裝置放入光照培養(yǎng)箱中25 ℃培養(yǎng)，光照周期為16 h白天/8 h夜晚。

培養(yǎng)8周后，將根從菌根室中取出后，F(xiàn)AA固定液固定1 d，然后用10%KOH(W/V)溶液90 ℃消化1～2 h，除去根中的細(xì)胞質(zhì)，以便于觀察。將根浸入1%HCl中酸化3～5 min后用臺(tái)盼藍(lán)染色[11]，進(jìn)行侵染率檢測(cè)。

1.7后代孢子產(chǎn)量和根外菌絲長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)后代孢子數(shù)量在解剖鏡下鏡檢；于顯微鏡(Olympus X51)下統(tǒng)計(jì)根外菌絲長(zhǎng)度。相對(duì)孢子產(chǎn)量、相對(duì)根外菌絲長(zhǎng)度計(jì)算公式如下：

相對(duì)孢子產(chǎn)量(%)= 處理組孢子產(chǎn)量/對(duì)照組孢子產(chǎn)量×100%

(2)

相對(duì)根外菌絲長(zhǎng)度(%)=處理組根外菌絲長(zhǎng)度/對(duì)照組根外菌絲長(zhǎng)度×100%

(3)

1.8數(shù)據(jù)分析利用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義分析，當(dāng)P<0.05 時(shí)，視作差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1離子注入對(duì)叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明，1.25×1015、2.50×1015、3.75×1015、5.00×1015、6.25×1015、7.50×1015ions/cm2劑量組孢子萌發(fā)率分別為76.7%、78.9%、70.3%、57.9%、34.3%、21.5%，CK1孢子萌發(fā)率為70.4%，CK2孢子萌發(fā)率為71.7%，各劑量組孢子萌發(fā)率與CK1差異顯著。

可以看出，不同劑量的低能離子注入對(duì)叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)率產(chǎn)生不同的影響。1.25×1015、2.50×1015ions/cm2劑量組顯著提高孢子萌發(fā)率；5.00×1015ions/cm2及以上劑量組抑制孢子萌發(fā)，其中6.25×1015ions/cm2劑量組可將孢子萌發(fā)率降至對(duì)照組的50%左右。出于當(dāng)代刺激效應(yīng)和誘變效應(yīng)兩方面的考慮，選取2.50×1015、6.25×1015ions/cm2兩劑組量進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2離子注入對(duì)叢枝菌根真菌早期菌絲生長(zhǎng)的影響由表2可知，2.50×1015ions/cm2劑量組孢子相對(duì)菌絲長(zhǎng)度為123.3%，顯著促進(jìn)了菌絲的生長(zhǎng)，而6.25×1015ions/cm2劑量組孢子相對(duì)菌絲長(zhǎng)度為74.1%,抑制菌絲的生長(zhǎng)。說(shuō)明不同劑量的低能離子注入會(huì)對(duì)叢枝菌根真菌早期的菌絲生長(zhǎng)造成不同程度的影響。

表2離子注入對(duì)叢枝菌根真菌菌絲長(zhǎng)度、真菌侵染率、相對(duì)孢子產(chǎn)量、相對(duì)根外菌絲長(zhǎng)度的影響

Table2Effectofionirradiationonhyphallength，colonizationrate，relativeporeyieldandrelativeextra-radicalhyphalofArbuscularMycorrhizalfungi%

注入劑量Injected volume×1015ions/cm2孢子相對(duì)菌絲長(zhǎng)度Hyphallength侵染率Infection rate相對(duì)孢子產(chǎn)量Relativepore yield相對(duì)根外菌絲長(zhǎng)度Relativeextra-radicalhyphalCK110070.701001002.50123.3*74.30103.20106.506.2574.1*69.1094.8096.10

注：*表示與CK1差異顯著

Note：* stands for significant differences with CK1

2.3離子注入對(duì)叢枝菌根真菌與蒺藜苜蓿共生的影響

2.3.1離子注入對(duì)叢枝菌根真菌侵染率的影響。叢枝菌根真菌的侵染效果是共生建立的關(guān)鍵因素。由表2可知，各處理組對(duì)侵染率影響均不顯著。說(shuō)明低能離子注入雖然影響了叢枝菌根真菌早期生長(zhǎng)，但其與蒺藜苜蓿的共生關(guān)系仍可正常建立。

2.3.2離子注入對(duì)叢枝菌根真菌后代孢子和根外菌絲生長(zhǎng)的影響。由表2可知，各處理組對(duì)后代孢子產(chǎn)量和根外菌絲的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。說(shuō)明離子注入的叢枝菌根真菌與蒺藜苜蓿建立共生關(guān)系后，仍可正常的完成其生命周期。

3 結(jié)論與討論

目前，低能離子注入對(duì)叢枝菌根真菌影響的研究極少。該研究結(jié)果表明，不同劑量的Ar離子注入對(duì)叢枝菌根真菌孢子萌發(fā)率產(chǎn)生不同的影響：1.25×1015、2.50×1015ions/cm2劑量組顯著提高孢子萌發(fā)率；5.00×1015ions/cm2及以上劑量組抑制孢子萌發(fā)，其中6.25×1015ions/cm2劑量處理可將孢子萌發(fā)率降至對(duì)照組的50%左右。出于利用當(dāng)代刺激效應(yīng)和誘變效應(yīng)兩方面的考慮，選取2.50×1015、6.25×1015ions/cm2兩劑量組進(jìn)行后續(xù)研究。2.50×1015ions/cm2劑量組顯著促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，而6.25×1015ions/cm2劑量組抑制菌絲的生長(zhǎng)。孢子萌發(fā)率和菌絲的生長(zhǎng)是叢枝菌根真菌初期生命活力的表征，低劑量的離子注入促進(jìn)這些指標(biāo)上升，對(duì)于在逆境中提高叢枝菌根真菌的活力有重要意義。而高劑量的離子注入抑制叢枝菌根真菌的存活和初期的生長(zhǎng)，說(shuō)明離子注入可能會(huì)對(duì)其產(chǎn)生誘變效應(yīng)。

由于專性共生的特點(diǎn)，菌根真菌對(duì)宿主植物根系的侵染是其生長(zhǎng)發(fā)育的先決條件，而侵染率是直接反映AM真菌對(duì)宿主植物親和性的指標(biāo)。侵染率的高低會(huì)影響菌根真菌從宿主植物獲取碳水化合物的能力，進(jìn)而影響菌根真菌的生長(zhǎng)發(fā)育如根外孢子萌發(fā)以及菌絲生長(zhǎng)等。AM 真菌的根外真菌生物量直接反映后代根外真菌的生長(zhǎng)狀況，其中包括孢子和菌絲的數(shù)量。在該試驗(yàn)中，各處理組對(duì)后代侵染率、孢子產(chǎn)量和根外菌絲的生長(zhǎng)均無(wú)顯著影響。說(shuō)明離子注入雖然會(huì)對(duì)AM真菌早期生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，但叢枝菌根真菌仍可完成其生命周期，菌與根的共生仍然能夠建立。這種結(jié)果意味著可以在高劑量離子注入后，對(duì)叢枝菌根真菌的生長(zhǎng)進(jìn)行長(zhǎng)期的觀測(cè)和篩選，這對(duì)于叢枝菌根真菌的離子束誘變育種工作具有重大意義。