劉星辰，鞠 青

（1.青島一中，山東青島 266071；2.青島市環(huán)境監(jiān)測中心站，山東青島 266071）

近年，石油作為重要能源之一，被世界各國廣泛使用。隨著海洋石油勘探業(yè)及石油海運業(yè)飛速發(fā)展，石油開采、儲存、運輸過程中產(chǎn)生的泄漏及運輸船舶的突發(fā)事故導(dǎo)致石油污染事故頻發(fā)，嚴(yán)重影響海洋生態(tài)系統(tǒng)的安全與健康[1-3]。在我國，石油烴污染已逐漸成為海洋污染的主要問題之一。原油化學(xué)成分復(fù)雜，遷移轉(zhuǎn)化過程也有較多變化，主要包括烴類化合物（飽和烴類、芳香烴類等）和非烴類組分（含硫化合物、含氮化合物）等[4-5]。其水溶性成分（water-accommodated fraction，WAF）是引起海洋生物毒性效應(yīng)的主要組分，其中毒性最大的是微量溶于水的芳香烴類化合物，如萘、蒽、芘、苯并芘。在污染產(chǎn)生的較短時間內(nèi)，中小分子量的多環(huán)芳烴，如萘、菲、芘、熒蒽是對海洋生物危害最大的4種成分[6]。

海洋微藻是海洋生物資源的重要組成部分，也是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的主要初級生產(chǎn)者。海洋微藻具有分布廣、數(shù)量多、繁殖快的特點，是多種污染物影響海洋生態(tài)系統(tǒng)的重要起點[7]。WAF能對海洋微藻產(chǎn)生毒性效應(yīng)，從而破壞海洋食物鏈，進而長時間影響海洋生物多樣性[8]。而且，由于海洋微藻處于食物鏈底端，若受到WAF的影響，毒性會隨食物鏈傳遞，影響到層級較高的生物，從而影響整個海洋生態(tài)系統(tǒng)[9]。

文中以近岸常見種三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum和小球藻Chlorella vulgaris，探索WAF對其生長的毒性效應(yīng)以及兩種微藻對WAF的降解能力，以揭示石油烴對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響，為海上溢油的環(huán)境影響研究提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微藻及其培養(yǎng)

實驗所用藻種為中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫的三角褐指藻和小球藻。2種微藻使用f/2培養(yǎng)基[10]進行培養(yǎng)。

將生長至指數(shù)生長期的微藻用于實驗。實驗海水為青島近海自然海水，紗布過濾后用0.45 μm的微孔濾膜抽濾并滅菌。接種微藻于250 mL錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為24±2℃，光照強度為3 000 lx，明暗周期為12 h：12 h。實驗期間保持所有實驗瓶受光均勻，并每天定時搖瓶3次。2種微藻相同處理。

1.2 原油水溶性組分（WAF）母液制備

原油取自勝利油田，放于陰涼處避光保存。

將已抽濾并滅菌的海水與原油按照1：9的體積比混合，在避光的條件下，將原油混合液置于磁力攪拌器上連續(xù)攪拌24 h，后將混合液倒入分液漏斗中靜置3 h以上，將分液漏斗中的水相放出，置于棕色試劑瓶中于冰箱（4～6℃）內(nèi)保存。用紫外分光光度計在225 nm波長下測定WAF母液中石油烴的濃度，并根據(jù)實驗需要對母液進行梯度稀釋。

1.3 WAF的毒性實驗

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，三角褐指藻和小球藻分9個等比濃度梯度進行培養(yǎng)。2種藻的培養(yǎng)液中含有的石油烴的濃度見表1，每組設(shè)3個平行，一次性培養(yǎng)96 h，在第0、24、48、72和96 h取樣，在光學(xué)顯微鏡下用血球計數(shù)板統(tǒng)計藻細(xì)胞的數(shù)目并計算細(xì)胞密度。

2種藻的相對生長率、抑制率及半最大效應(yīng)濃度（half maximal effective concentration,EC50）按照國際經(jīng)合組織（OECD）[11]和國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[12]的化學(xué)品藻類生長抑制標(biāo)準(zhǔn)方法計算。

表1WAF濃度設(shè)置Tab.1 Different concentration of WAF

藻類相對生長率的計算：

μt：時間為t時，藻的相對生長率；N1：t1時藻類細(xì)胞密度（起始密度）；Nn：tn時的藻類細(xì)胞密度。

藻類抑制率的計算：

I：時間為t時，藻的抑制率；μC：對照組相對生長速率；μt：時間為t時，藻的相對生長率。將抑制率導(dǎo)入PROBIT線性回歸方程得出96 h EC50，并檢驗。

1.4 微藻對石油烴的降解

石油烴對微藻的毒性脅迫實驗完成后，測定培養(yǎng)液中石油烴的剩余量。降解率的計算[13]：

η：WAF降解率，%；C0：空白對照的石油烴質(zhì)量濃度，mg/L；C1：溶液中的石油烴質(zhì)量濃度，mg/L。

(3)1型糖尿病患者活動時,應(yīng)把握好胰島素劑量、飲食與活動三者之間的相互關(guān)系,因其在接受胰島素治療時,常波動于相對不足和過多之間。前者可因活動時肝糖輸出明顯增多而葡萄糖利用不增加導(dǎo)致血糖升高、游離脂肪酸和酮體生成增加;后者易造成低血糖。一般可在活動前少量補充額外食物或減少胰島素用量,活動量不宜大,時間不宜過長,以15~30min為宜,活動時隨身攜帶甜點及寫有姓名、家庭住址和病情的卡片以應(yīng)急需。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各指標(biāo)的差異顯著性采用SPSS軟件進行單因素方差分析，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 原油水溶性組分WAF對2種微藻種群增長的影響

不同濃度的WAF對三角褐指藻細(xì)胞密度的影響如圖1所示。從圖1可以看出，對照組的三角褐指藻生長良好，呈指數(shù)增長。在48～72 h之間，低劑量處理組（第8、9組）中，受到WAF的刺激，三角褐指藻細(xì)胞密度高于對照組（P＜0.05）。隨著脅迫時間延長，WAF的劑量增大，高WAF濃度組（第1、2組）的細(xì)胞密度顯著低于對照組（P＜0.05）。經(jīng)WAF處理后，小球藻細(xì)胞密度變化如圖2所示，低濃度的WAF（處理組8）對小球藻的生長同樣具有促進作用，96 h的藻細(xì)胞密度顯著高于對照組（P＜0.05）。96 h時，高濃度 WAF組（第1、2、3、4組）的藻密度隨WAF濃度的增大而顯著降低（P＜0.05）與對照組差異顯著，呈現(xiàn)明顯的劑量-時間效應(yīng)。

圖1 WAF對三角褐指藻細(xì)胞密度的影響Fig.1 Eeffects of WAF on the cell density of P.tricornutum

分析三角褐指藻和小球藻的相對生長率可知（表2），低濃度WAF組中，三角褐指藻的相對生長率僅僅略有降低，與對照組相比降低5%。經(jīng)高濃度WAF（第1組）脅迫的三角褐指藻的相對生長率顯著低于對照組21%（P＜0.05）。WAF濃度為0.36 mg/L時，小球藻的相對生長率略高于對照組但差異不顯著（P=0.301），而相同處理組中，三角褐指藻的相對生長率低于其對照組，且差異顯著（P＜0.05）。之后隨著WAF濃度增加且處理時間延長，小球藻的相對生長率逐漸降低。相對于對照組，高濃度處理組（第1組）中小球藻的相對生長率降低75%。與三角褐指藻相比，小球藻相對生長率的降幅較大。

2.2 原油水溶性組分WAF對2種微藻種群的抑制

不同濃度的WAF對三角褐指藻和小球藻96 h的抑制率見表3。結(jié)果表明，低濃度WAF（9、8、7、6 和 5 組）對三角褐指藻和小球藻的抑制率較低。處理組8中，WAF對小球藻的抑制率為-3.00%。表明該濃度下，WAF對小球藻生長具有明顯的刺激作用。隨著WAF的濃度增加（1、2、3和 4組），其對三角褐指藻和小球藻的生長抑制率逐漸提高，而且對小球藻的抑制率顯著高于同組的三角褐指藻。隨著WAF濃度升高，其對小球藻生長的抑制顯著增大（38.2%～74.0%），而對三角褐指藻的脅迫較小，抑制率為5.95%～21.0%。

圖2 WAF對小球藻細(xì)胞密度的影響Fig.2 Eeffects of WAF on the cell density of C.vulgaris

表2 原油WAF對2種海洋微藻相對生長率Tab.2 The relative growth rate of P.tricorntum and C.vulgaris

WAF最高濃度處理組（27.88 mg/L）中，三角褐指藻96 h時的抑制率僅為21.0%，計算WAF對其的EC50為49.1 mg/L。根據(jù)不同濃度WAF對小球藻的抑制率計算EC50。WAF對小球藻的96 h EC50為13.2 mg/L。因此三角褐指藻的96 h EC50顯著高于小球藻。

表3 原油WAF對2種海洋微藻抑制率Tab.3 The Inhibition rate of WAF on P.tricorntum and C.vulgaris

2.3 2種海洋微藻對WAF的降解效果

表4 2種海洋微藻在不同濃度WAF培養(yǎng)后WAF的剩余量及降幅Tab.4 The beginning and end WAF concentrations of two microalgae cultured

3 討論

研究結(jié)果表明，低劑量處理組（第8組）WAF對三角褐指藻和小球藻的生長有輕微的促進作用，其可能的原因是低劑量的毒物對微藻生長有刺激作用。黃逸君等[14]研究發(fā)現(xiàn)在低濃度的WAF刺激下，浮游植物會爆發(fā)性增長。其他研究人員通過實驗室及野外圍隔實驗也表明，海水中低濃度的WAF能夠促進浮游植物的生長[15-18]。鄧結(jié)平等[19]的研究表明，在低濃度四溴雙酚A（TBBPA）（1.0 mg/L）的作用下，牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri的相對生長率略高于對照組。低濃度的毒物對微藻生長有刺激效應(yīng)，其原因可能是藻細(xì)胞內(nèi)自由基含量升高，從而促進其生理生化代謝及繁殖，以達(dá)到稀釋毒性脅迫的目的[20]。還有研究推測低濃度WAF能促進藻類生長是由于水體中的微生物能夠降解石油烴中的部分化合物，將其轉(zhuǎn)化為藻類可以利用的碳源，從而表現(xiàn)出低濃度的WAF能夠促進藻類生長的現(xiàn)象[17-18]。因此有研究認(rèn)為，由低濃度WAF引起的浮游植物大量繁殖可能是赤潮的誘因之一[14]。

96 h時，高WAF濃度組的三角褐指藻和小球藻藻密度隨WAF濃度的增大而顯著降低并呈現(xiàn)明顯的劑量時間效應(yīng)。許多研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的WAF通過影響浮游植物的生理過程和生化組成，降低其細(xì)胞密度。例如，高濃度的WAF能夠改變浮游植物體內(nèi)的葉綠素a的含量對浮游植物造成嚴(yán)重影響[21-23]，還能抑制浮游植物吸收碳源和營養(yǎng)鹽，抑制細(xì)胞分裂、光合作用以及呼吸作用[24]。石油烴中的某些組分還能夠破壞藻類細(xì)胞中質(zhì)膜、線粒體膜以及葉綠體膜等結(jié)構(gòu)，從而抑制微藻的正常生長及代謝[25]。本研究中，三角褐指藻和小球藻在高濃度WAF組中細(xì)胞密度的下降，可能正是由于上述生理過程受到影響所致。

分析WAF對2種微藻種群增長的影響，低濃度WAF處理條件下，小球藻的藻密度和增長率較高；隨著WAF的濃度增大，處理時間延長，小球藻的藻密度和增長率大幅降低，降低幅度顯著高于三角褐指藻，可見WAF對小球藻的抑制率顯著高于三角褐指藻。而且三角褐指藻的EC50遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小球藻，表明兩種微藻對WAF的耐受性不同。與本研究類似，大量研究發(fā)現(xiàn)，不同藻類對同種污染物的耐受能力存在明顯的種間差異。例如，三角褐指藻和淡水綠藻Pseudokirchneriella subcapitata對表面活性劑的耐受性較強，而中肋骨條藻Skeletonema costatum和淡水微藻柵藻Scenedesmus quadricauda對表面活性劑較為敏感，可能是與藻細(xì)胞內(nèi)解毒代謝相關(guān)酶的活性有關(guān)[26]。鄧結(jié)平等[19]研究了四溴雙酚A（TBBPA）對7種不同微藻生長的影響，結(jié)果表明微擬球藻Nannochloropsis salina和牟氏角毛藻對TBBPA最為敏感，可以作為指示生物。

實驗結(jié)束時，2種微藻培養(yǎng)液中WAF的濃度均有顯著降低，表明三角褐指藻和小球藻對不同濃度的WAF均有一定程度的降解作用。低濃度WAF脅迫下，小球藻對其的降解率為76.1%，大于三角褐指藻。隨著WAF濃度增高，三角褐指藻的降解能力增強。高濃度處理組（第4組）中，三角褐指藻對WAF的降解率為78.9%。張玉榮等發(fā)現(xiàn)微綠球藻Nannochloris oculata、中肋骨條藻和塔瑪亞歷山大藻Alexandrium tamarense對濃度低于2 mg/L的石油烴具有較好的降解效果[27]。多項研究表明小球藻屬Chlorella、舟形藻屬Navicula和菱形藻屬Nitzschi的藻類也可以對WAF進行降解和轉(zhuǎn)化[28-29]。當(dāng)石油濃度為3.5 mg/L時，小球藻和杜氏鹽藻對帶共軛雙鍵的烴類化合物和芳烴的降解效率均最大，而且小球藻的降解能力略好于鹽藻[30]。因此可以推斷，不同藻類對WAF的降解率也有不同，結(jié)合WAF對2種微藻種群增長的影響，低濃度WAF對小球藻的生長有促進作用，小球藻生長較好，藻密度較高，對WAF的降解率高。而三角褐指藻對高濃度WAF的耐受性好，細(xì)胞密度較高，因此其對WAF的降解率也較高。之后隨著WAF濃度的繼續(xù)升高，三角褐指藻生長受到抑制，降解率逐漸降低。

4 結(jié)論

（1）處理組8中，小球藻的相對生長率為0.73，高于對照組，且WAF對其的抑制率為-3.00，因此推斷低濃度的WAF能夠刺激小球藻的生長。隨WAF濃度增加，三角褐指藻和小球藻的生長受到抑制。抑制程度呈現(xiàn)明顯的時間和劑量效應(yīng)。

（2）小球藻對低濃度的WAF適應(yīng)性較好，生長迅速。而三角褐指藻對高濃度的WAF耐受性較好，最高濃度處理組的抑制率僅為21.0%，而小球藻的抑制率為74.0%。表明不同藻類對WAF的耐受性不同，耐受濃度范圍也不同。

（3）三角褐指藻和小球藻對WAF都有降解作用，而且三角褐指藻對3.49 mg/L WAF的降解率為78.9%，降解率較高，可以用于降解含有較高濃度WAF的污染海水。