育亨賓樹皮中育亨賓提取工藝研究

張 敏，閆高穎，張必榮，王 平，任曉峰

(1.陜西天谷生物科技集團(tuán)有限公司，西安 710065；2.漢中天然谷生物科技股份有限公司，漢中 723100)

育亨賓(yohimbine)是一種有興奮作用的天然單萜吲哚類生物堿，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為17-α-羥基育亨賓-16-α-羧酸甲酯(methyl 17-α-hydorxy-yohimban-16-α-carboxylate)[1]，最早從西非茜草科育亨賓樹(Corynantheyohi-mbeK.Schum)的干皮中提取[2]，樹皮中總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.1%，其中育亨賓堿占總生物堿的10%～15%[1]。在非洲育亨賓以樹皮入藥，可在一年中的任何時候采集，作為催欲藥的使用歷史悠久[2]。我國夾竹桃科植物蘿芙木屬(Rauvlfia)根中含有少量育亨賓，據(jù)報道，以云南景洪產(chǎn)的蘿芙木中育亨賓含量較其他產(chǎn)區(qū)高[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，育亨賓作為一種有效的α2-腎上腺素受體拮抗劑[5]，在治療男性性功能障礙方面作用顯著，被認(rèn)為是治療陽痿的有效藥物[6]，同時該活性物質(zhì)具有擴(kuò)張外周血管、降低血壓[7-8]和消炎[9-12]等作用。目前對育亨賓的研究主要集中在檢測方法[13-15]、藥理學(xué)[16]和藥效學(xué)[17-18]等方面，對育亨賓的提取工藝報道較少。雷智東等[19]以鹽酸育亨賓為定量檢測指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑、料液比和提取時間3個因素對鹽酸育亨賓提取率的影響；郭占京等[20]以廣西產(chǎn)的蘿芙木為原料，采用響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取法，以育亨賓提取量為響應(yīng)值，選取粒度、提取液pH值、提取時間和料液比為自變量，考察育亨賓的工藝條件，該工藝下的參數(shù)對以育亨賓樹皮為原料提取的有效物質(zhì)含量和穩(wěn)定性有待考察。本研究以育亨賓為含量檢測指標(biāo)，全面考察提取溶劑、料液比、提取時間和提取溫度等因素對育亨賓提取率的影響，用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計，優(yōu)化育亨賓最佳提取工藝，為育亨賓提取物的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)；BP25S 型電子天平(德國賽多利斯公司)；TQ-100型高速萬能粉碎機(jī)(永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司)；高效液相色譜(Thermo Ultimate 3000型四元泵、二極管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器)(賽默飛世爾科技有限公司)；Q型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Maxima超純水機(jī)(美國基因公司)。

1.2試藥 育亨賓樹皮購自西安市萬壽路藥材市場經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室鑒定為非洲植物育亨賓樹CorynanteYohimbeK.Schum的干燥樹皮；育亨賓對照品(美國Sigma公司，批號BR-04484)；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1育亨賓的含量測定

2.1.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Thermo TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：磷酸二氫鉀緩沖液-乙腈(5∶1，pH值為4.0)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，育亨賓對照品和樣品色譜圖見圖1。結(jié)果表明，樣品中的育亨賓與其他組分達(dá)到了基線分離，分離度大于2.0。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.樣品；C.陰性對照品；1.育亨賓。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances；B.sample；C.negative control;1.yohimbine.

2.1.2對照品溶液的制備 精密稱取1 mg育亨賓對照品，用體積分?jǐn)?shù)為90%的甲醇充分溶解并定容至1 mL量瓶中，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液。

2.1.3供試品溶液的制備 稱取干燥粉碎后的育亨賓樹皮粗粉1.0 g，置于100 mL量瓶中，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為 90%的甲醇溶解，超聲提取30 min，冷卻至室溫，定容至100 mL，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冷藏備用。

2.1.4陰性對照品溶液的制備 取空白樣品，按照2.1.3項(xiàng)下方法制備。

2.1.5線性關(guān)系考察 吸取2.1.2項(xiàng)下制備的育亨賓對照品溶液適量，分別稀釋成質(zhì)量濃度為800，400，200，100，50和10 μg·mL-1的系列對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，4 ℃冷藏備用。按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣10 μL，分別重復(fù)3次，記錄峰面積。以對照品質(zhì)量濃度(x)對峰面積(y)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程y=2.232 7x-3.913 6(r=0.999 9)。育亨賓質(zhì)量濃度在10～800 μg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取育亨賓對照品溶液10 μL，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定育亨賓峰面積的RSD值為0.8%，結(jié)果表明，精密度良好。

結(jié)合學(xué)生已經(jīng)掌握的理論知識和實(shí)踐技能，我們可以借助于“項(xiàng)目”任務(wù)，來強(qiáng)化學(xué)生對知識、技能的復(fù)合應(yīng)用。旅游管理涵蓋的現(xiàn)實(shí)問題較多，通過“項(xiàng)目”研究教學(xué)模式，以“多問題、多前提、多變量”為項(xiàng)目分析思路，將學(xué)生進(jìn)行分組，鼓勵各組學(xué)生合作、探究，解決問題。該模式需要強(qiáng)調(diào)：一是“項(xiàng)目”難度的把控，要適當(dāng)；二是“項(xiàng)目”劃分要體現(xiàn)小組合作研究，強(qiáng)調(diào)學(xué)生間的配合；三是突出“項(xiàng)目”完成成果形式，可以是研究報告、論文、對策建議等。

2.1.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.1.3項(xiàng)下制備的供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，6，8，10和12 h進(jìn)樣，測定育亨賓的峰面積RSD值為0.9%，結(jié)果表明，供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取5份2.1.3項(xiàng)下制備的供試品溶液5份進(jìn)行測定，育亨賓峰面積的RSD值為2.5%，結(jié)果表明，樣品重復(fù)性良好。

2.1.9回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取5份已知含量的育亨賓樹皮粗粉0.1 g，分別置于10 mL量瓶中，加入1 mg對照品溶液，按照2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，平均回收率為103.40%，RSD值為0.85%。

2.2樣品測定 按照2.1.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液；分別精密吸取對照品與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)平行測定3次，記錄峰面積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算育亨賓含量。結(jié)果育亨賓的含量分別為6.23%，6.19%和6.26%，平均含量為6.23%，RSD值為0.56%。

2.3單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1提取溶劑種類的確定 稱取2 g育亨賓粗粉，4份，分別溶于10 mL質(zhì)量濃度為1 g·L-1的酒石酸、質(zhì)量濃度為1 g·L-1的檸檬酸、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的醋酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的鹽酸中，料液比為1∶22，100 ℃回流提取3次，每次1.5 h，計算育亨賓的收率，確定最佳提取溶劑，結(jié)果顯示，以育亨賓的收率為指標(biāo)成分，對4組提取溶劑進(jìn)行考察，隨著提取溶劑酸性的增強(qiáng)，育亨賓的收率呈上升趨勢；當(dāng)提取溶劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的鹽酸時，收率可達(dá)106.6%。故選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的鹽酸作為提取溶劑。

2.3.2提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定 稱取2 g育亨賓粗粉5份，分別溶于10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%的鹽酸溶液中，料液比為1∶22，100 ℃回流提取3次，每次1.5 h，計算育亨賓的收率，確定最佳提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示，以育亨賓的收率為指標(biāo)成分，對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽酸進(jìn)行考察，當(dāng)鹽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%時，收率可達(dá)最大值107.5%；而后隨著提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，育亨賓的收率呈下降趨勢，推測強(qiáng)酸破壞了目標(biāo)成分育亨賓的溶出，影響了育亨賓的提取效果，故選擇提取溶劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的鹽酸。

2.3.3料液比的確定 稱取2 g育亨賓粗粉4份，溶于10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的鹽酸溶液中，分別在料液比為1∶20，1∶22，1∶26和1∶28的條件下，100 ℃回流提取3次，每次1.5 h，計算育亨賓收率，確定最佳料液比，結(jié)果顯示，以育亨賓的收率為指標(biāo)成分，對不同料液比進(jìn)行考察，隨著料液比的增加，育亨賓的收率呈上升趨勢，但當(dāng)料液比從1∶22上升到1∶28時，收率增加緩慢，綜合考慮，選擇料液比為1∶22。

2.3.4提取時間的確定 稱取2 g育亨賓粗粉5份，分別溶于10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的鹽酸溶液中，在料液比為1∶22的條件下，提取時間分別為3.0，2.5，2.0，1.5和1.0 h，100 ℃回流提取3次，計算育亨賓收率，確定最佳提取時間，結(jié)果顯示，以育亨賓的收率為指標(biāo)成分，對提取時間進(jìn)行考察，當(dāng)提取時間從1 h增加到2 h時，育亨賓的收率呈明顯上升趨勢；當(dāng)提取時間從2 h增加到3 h時，育亨賓的收率呈明顯下降趨勢。當(dāng)提取時間為2 h時，育亨賓的收率達(dá)到最大值103.7%，因此選擇提取時間為2 h。

2.3.5提取溫度的確定 稱取2 g育亨賓粗粉，5份，分別溶于10 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的鹽酸溶液中，料液比為1∶22，每次1.5 h，回流提取3次，在提取溫度為60，70，80，90和100 ℃條件下，計算育亨賓收率，確定最佳提取溫度，結(jié)果顯示，以育亨賓的收率為指標(biāo)成分，對提取溫度進(jìn)行考察，隨著提取溫度的升高，育亨賓的收率呈明顯上升趨勢；當(dāng)提取溫度為100 ℃時，育亨賓的收率達(dá)到最大值106.9%，因此選擇提取溫度為100 ℃。

2.4正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、提取溫度 (B)、料液比(C)和提取時間(D)為主要因素，每個因素各選取3個水平，以育亨賓含量為考察指標(biāo)，設(shè)計L9(34)正交實(shí)驗(yàn)確定最佳提取工藝，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1至表3。

表1正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

水平因素A,提取溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%B,提取溫度/℃C,料液比D,提取時間/h10.1801∶221.520.2901∶262.030.31001∶282.5

由表2可知，育亨賓含量為育亨賓提取工藝的考察指標(biāo)，由極差R可知，各因素的影響程度依次為A>B>C>D。由表3可知，因素A(提取溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù))對育亨賓的提取有極顯著性意義，因素B(提取溫度)對育亨賓的提取有顯著性意義，因素C和因素D對提取無顯著性意義，可根據(jù)生產(chǎn)條件任取一水平，從節(jié)約能源和提高生產(chǎn)效率方面考慮，料液比為C1(1∶22)，提取時間為D1(1.5) h，得出較佳提取工藝，即 22倍量的水(1∶10∶6∶6)，100 ℃條件下提取3次，每次1.5 h。

2.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稱取適量育亨賓粗粉3份，按照最終選取的工藝進(jìn)行提取，育亨賓的平均收率大于103%。

表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of the orthogonal experiment

編號ABCD育亨賓含量/%111115.99212226.06313336.24421236.49522316.87623127.23731325.93832136.15933216.32K118.2918.4119.3719.18K220.5919.0818.8719.22K318.4019.7919.0418.88Ⅰ6.0976.1376.4576.393Ⅱ6.8636.3606.2906.407Ⅲ6.1336.5976.3476.293R0.7670.4600.1670.113

表3方差分析結(jié)果

Tab.3 Results analysis of variance

方差來源離差平方和自由度FFα顯著性A1.122248.78F0.1=9**B0.317213.78F0.05=19*C0.04321.87D0.02321.00誤差02

注：*P<0.1為有極顯著性意義，**P<0.05為有顯著性意義。

3 討論

本研究考察了提取溶劑、提取溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取溫度5個因素對育亨賓提取率的影響，育亨賓樹皮中有效物質(zhì)以生物堿的形式存在，采用酸提取增加其溶解性，篩選出以鹽酸為提取溶劑，進(jìn)一步通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，得到了育亨賓樹皮中提取育亨賓的最佳提取條件為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的鹽酸溶液，料液比為1∶22，提取溫度為100 ℃，提取3次，每次1.5 h，經(jīng)工藝驗(yàn)證，育亨賓的平均提取率高于103%，表明本提取方法提取率高于現(xiàn)有報道[19]，且本研究所確定的育亨賓含量測定方法操作簡單、重復(fù)性好，在生產(chǎn)過程中作為質(zhì)量控制方法可行，該提取工藝穩(wěn)定，已應(yīng)用到育亨賓提取物的工業(yè)化生產(chǎn)中。