李秀良，李芳玉，曹艷紅，吳柱月，黨瑞華，李紹波，陳 宏，雷初朝*

(1.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西南寧 530001；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100)

中國黃牛是指除牦牛和水牛以外的所有家牛，起源上包括普通牛和瘤牛兩個(gè)牛種，二者的共同祖先是原牛[1]。作為世界牛品種資源寶庫的重要組成部分，我國地方黃牛品種具有豐富的遺傳多樣性。1986年，邱懷[2]在《中國牛品種志》將中國黃牛整理分類后分成了28個(gè)地方黃牛品種，同時(shí)按照地理分布區(qū)域的不同，把中國黃牛分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛3大類。潿洲牛的中心產(chǎn)區(qū)在廣西北海市的潿洲和斜陽兩島，其中潿洲島的牛群約占總數(shù)的96%，斜陽島占4%，在北海市及合浦縣等地區(qū)也有少量分布。潿洲牛經(jīng)過產(chǎn)區(qū)風(fēng)土馴化，具有體型飽滿、耐熱和耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖率高、屠宰率高等優(yōu)點(diǎn)。隨著潿洲島旅游開發(fā)力度加大，為了符合市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的需要，潿洲牛作為役用逐漸減少，更多的作為肉用[3]。

Y染色體由雄性特異區(qū)(MSY)和擬常染色體區(qū)(PAR)兩部分組成，其中MSY區(qū)在減數(shù)分裂時(shí)不與X染色體發(fā)生重組[4]，具有父系遺傳特性，且Y染色體的單倍型完整，具有較低的突變率，不易受重組和回復(fù)突變等因素影響，是探明父系遺傳多樣性、起源和馴化歷史等研究的理想工具[5]。根據(jù)以往的一些研究發(fā)現(xiàn)，家牛具有Y1、Y2和Y3三種單倍型組，其中Y1和Y2單倍型組代表普通牛起源，而Y3單倍型組為瘤牛起源[6,7]。利用位于Y染色體MSY區(qū)的單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(Y-SNPs)可以確定家牛的Y染色體單倍型組[6]，利用微衛(wèi)星標(biāo)記(Y-STRs)，可以更精確地反映3種單倍型組內(nèi)豐富的Y染色體單倍型[8,9]，將這兩種標(biāo)記結(jié)合起來使用可以更完整地反映Y染色體單倍型結(jié)構(gòu)。

Zhang等[10]利用5個(gè)Y-SNPs(ZFY-9、ZFY-10、DDX3Y-7、DDX3Y-1和UTY-19)標(biāo)記對(duì)4個(gè)中國地方牛品種共96個(gè)雄性個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5個(gè)Y-SNPs標(biāo)記能夠?qū)⑵胀ㄅ：土雠^(qū)分開來。Cai等[11]對(duì)25個(gè)中國地方黃牛品種共423頭個(gè)體的2個(gè)Y-STRs(UMN2404和UMN0103)標(biāo)記進(jìn)行基因分型和多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)位點(diǎn)具有明顯的多態(tài)性，可以區(qū)分普通牛和瘤牛血統(tǒng)。迄今為止，尚未見到有關(guān)潿洲牛分子水平上的Y染色體遺傳多樣性及父系起源的報(bào)道。因此，本研究利用2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)及2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)對(duì)28頭潿洲牛公牛進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，通過分析潿洲牛Y染色體的單倍型組成，來探明該群體的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及父系起源。

1 材料與方法

1.1 采樣及基因組DNA提取

在廣西壯族自治區(qū)潿洲島保種場(chǎng)采集潿洲牛28頭公牛的耳組織，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，采用常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，稀釋濃度至10～20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴(kuò)增

參照Gotherstrom等[12]和Ginja等[8]報(bào)道的2個(gè)家牛Y-SNPs標(biāo)記(即UTY-19和ZFY-10)以及Edwards等(2011)的研究中的Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)合成四對(duì)引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。25 μLPCR體系：2×PrimeSTAR Max Premix (上海寶生物公司)12.5 μL，上、下游引物 (10 pmol/L)各0.5 μL，模板DNA 1 μL，超純水10.5 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃變性10 s，Ta℃(見表1)退火15 s，72℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)，后冷卻至4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.5%瓊脂糖凝膠(含GoldView核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)。

1.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序、分型及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

將PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序和分型，利用DNASTAR 7.1(DNASTAR, Madison, WI, USA)軟件對(duì)Y-SNPs測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用GeneMarker V1.91軟件對(duì)Y-STRs分型結(jié)果進(jìn)行查看和校正。利用Y-SNPs的2個(gè)標(biāo)記先確定家牛的單倍型組，繼而結(jié)合Y-STRs的2個(gè)標(biāo)記的分型結(jié)果，二者共同確定出每頭黃牛的Y染色體單倍型(Y-SNP-INRA189-BM861)。最后使用Arlequin 3.0軟件計(jì)算群體單倍型多樣度(H±SD)。

2 結(jié)果與分析

通過對(duì)28頭潿洲牛公牛的2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)的測(cè)序分析，并參考Gotherstrom等[12]和Ginja等[8]對(duì)家牛Y染色體單倍型組的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表明：這兩個(gè)Y-SNPs標(biāo)記在28頭潿洲牛中均具有多態(tài)性，其中UTY-19標(biāo)記發(fā)現(xiàn)一個(gè)C>A 核苷酸顛換，在ZFY-10標(biāo)記發(fā)現(xiàn)1個(gè)C>T核苷酸轉(zhuǎn)換和1個(gè)GT插入/缺失，表明28頭潿洲牛只包含Y3一種單倍型組。對(duì)2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果顯示：INRA189有兩種等位基因，大小分別為88 bp和90 bp，而BM861只有一個(gè)156 bp的等位基因。結(jié)合Y-SNPs和Y-STRs標(biāo)記確定潿洲牛的單倍型為Y3-88-156和Y3-90-156(表2)，頻率分別為89.29%(25/28)和10.71%(3/28)，表明潿洲牛只有1個(gè)瘤牛父系起源。潿洲牛群體的單倍型多樣度為0.1984±0.0924，表明父系遺傳多樣性很低。

表1 家牛2個(gè)Y-SNPs位點(diǎn)及2個(gè)Y-STRs位點(diǎn)的名稱、位置、退火溫度與引物序列

表2 潿洲牛Y染色體單倍型與單倍型頻率

3 討論

Y染色體分子遺傳多樣性是研究動(dòng)物父系起源和群體遺傳多樣性的重要工具。近年來，Y-SNPs標(biāo)記和 Y-STRs標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物Y染色體遺傳多樣性研究[6-9]，將這兩種標(biāo)記結(jié)合起來使用可以更精確地反映Y染色體單倍型結(jié)構(gòu)。近幾年來，國內(nèi)外越來越多的研究已經(jīng)將二者結(jié)合起來分析黃牛群體的Y染色體遺傳多樣性和父系起源[8]。潿洲牛是廣西自治區(qū)優(yōu)良的地方品種，目前為止，關(guān)于潿洲牛的分子水平上的遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)和父系起源的研究未見報(bào)道。

中國黃牛主要存在普通牛Y2和瘤牛Y3兩種父系起源，普通牛在中國北方地區(qū)占優(yōu)勢(shì)，瘤牛主要分布在南方地區(qū)，中原地區(qū)為二者交匯處[6]。本研究結(jié)果表明潿洲牛只有一個(gè)Y3單倍型組，說明潿洲牛只有1個(gè)瘤牛父系起源，潿洲牛分布在南方地區(qū)，與常振華等[6]研究結(jié)論相符合。夏小婷等[13]對(duì)32頭關(guān)嶺牛的Y-SNPs(USP9Y基因)和2個(gè)STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)進(jìn)行遺傳性分析，發(fā)現(xiàn)關(guān)嶺牛以瘤牛Y3父系起源為主，還具有普通牛Y2父系起源。侯佳雯等[14]利用2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)對(duì)35頭皖南公牛進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)皖南牛具有Y1、Y2和Y3 3種單倍型組，以瘤牛Y3父系起源為主，其中Y1單倍型組可能是由外來牛品種的雄性基因滲入所致[7]。李芳玉等[15]利用2個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(UTY-19和ZFY-10)和2個(gè)Y-STRs標(biāo)記(INRA189和BM861)，發(fā)現(xiàn)49頭大別山牛全部為Y3-88-156單倍型，表明該品種只有Y3瘤牛父系起源，其遺傳多樣性很低，表明其瘤牛種質(zhì)特性單一、穩(wěn)定。關(guān)嶺牛、皖南牛、大別山牛與潿洲牛都為南方黃牛，其中潿洲牛只有Y3單倍型組而不具有Y1和Y2單倍型組，說明潿洲牛和大別山牛一樣，只有一個(gè)瘤牛父系來源，血統(tǒng)單一，沒有受普通牛Y2的影響，也不存在外來牛品種的雄性基因滲入現(xiàn)象，其遺傳資源保存較好。

單倍型多樣度是衡量一個(gè)群體變異程度的重要指標(biāo)。目前在分子水平上尚未見到有關(guān)潿洲牛單倍型多樣度的報(bào)道，本研究中28頭潿洲牛的Y染色體單倍型多樣度為0.1984±0.0924，低于我國16個(gè)黃牛品種的Y染色體單倍型多樣度的平均值[7]。說明潿洲牛的父系遺傳多樣性較低。潿洲牛是役肉兼用型黃牛地方品種，潿洲島和斜陽島與內(nèi)陸有大海相隔，長期以來，潿洲牛都是本品種自然交配進(jìn)行純種繁殖。公牛的選育多采用選優(yōu)去劣的方法，大部分公牛被閹割，只留少數(shù)做種用，可能是導(dǎo)致本品種的遺傳多樣性較低的原因。這也說明潿洲牛品種的遺傳基礎(chǔ)穩(wěn)定，品種較純。近年來，潿洲牛群體數(shù)量有逐年下降的趨勢(shì)，該品種處于瀕危維持狀態(tài)[3]，因此，應(yīng)當(dāng)加大潿洲牛保種開發(fā)力度，建立健全潿洲牛保種體系，使得這一優(yōu)良的種質(zhì)資源得以保護(hù)和開發(fā)利用。