李廣禎，馬志杰*，陳生梅，林 元，李瑞哲，劉書(shū)杰，楊國(guó)太，周桑加

(1 青海省高原家畜遺傳資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；2 青海省同德縣農(nóng)牧和水利局，青海 同德 813200)

前言

牦牛(Bosgrunniens)能在空氣稀薄、高紫外線(xiàn)、寒冷和牧草生長(zhǎng)期短的高寒生態(tài)環(huán)境中生活自如，是青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的標(biāo)志性畜種，可為當(dāng)?shù)夭?、蒙、回等民族及其他游牧民族提供肉、奶、毛、絨、皮、交通和燃料等生產(chǎn)、生活必需品，是青藏高原民族文化重要的組成部分[1]。Y染色體具有遵循父系遺傳、突變率低、不易受重組影響等特點(diǎn)，是開(kāi)展哺乳動(dòng)物父系遺傳多樣性、種群歷史動(dòng)態(tài)、起源和進(jìn)化等研究強(qiáng)有力的工具[2]。近年來(lái)，Y染色體單核苷酸多態(tài)性(Y-SNP)和Y染色體微衛(wèi)星(Y-STR)標(biāo)記作為2種主要的Y染色體分子標(biāo)記，已被用于牦牛的父系起源、遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等研究[3-7]。Li等[3]最早通過(guò)對(duì)高原、環(huán)湖和天祝白牦牛共65頭公牦牛的16個(gè)Y染色體基因片段進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)5個(gè)Y染色體基因片段(即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY2和OFD1Y10)中6個(gè)Y-SNPs可用于牦牛父系遺傳分析，共確定了3種單倍型，初步推斷牦牛擁有2個(gè)高度分化的父系支系。Ma等[4]基于Li等[3]報(bào)道的5個(gè)牦牛Y-SNPs標(biāo)記，對(duì)青海省9個(gè)牦牛品種(群體)進(jìn)行系統(tǒng)的父系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳背景分析，表明青海牦牛具有較豐富的父系遺傳多樣性，由2大父系支系組成，發(fā)現(xiàn)大通牦牛品種和曲麻萊牦牛(即玉樹(shù)牦牛)群體均擁有特殊的單倍型。隨后，為系統(tǒng)探究中國(guó)牦牛的父系遺傳多樣性、譜系地理結(jié)構(gòu)、分化、聚類(lèi)關(guān)系、分子變異及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，馬志杰等[5-7]基于上述5個(gè)Y-SNPs標(biāo)記和1個(gè)Y-STR INRA189標(biāo)記的聯(lián)合對(duì)家牦牛11個(gè)地方品種(即九龍、麥洼、娘亞、斯布、帕里、高原、環(huán)湖、甘南、巴州、中甸和天祝牦牛)、1個(gè)培育品種(即大通牦牛)和3個(gè)群體(即塔縣、雪多和類(lèi)烏齊牦牛)共682頭公牦牛和8頭野牦牛公牛進(jìn)行父系遺傳綜合分析，表明我國(guó)牦牛擁有豐富的父系遺傳多樣性，遺傳分化程度較高，品種(群體)間無(wú)明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)，更多的遺傳變異存在于品種(群體)內(nèi)和品種(群體)間，由2個(gè)父系支系組成(即有2個(gè)父系起源)，16個(gè)牦牛品種(群體)可明顯的分為5類(lèi)，推測(cè)青海省可能是牦牛的起源與馴化地。上述研究為深入了解牦牛的父系遺傳多樣性水平、群體結(jié)構(gòu)組成、分化程度、起源、分類(lèi)和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)展牦牛種質(zhì)資源的發(fā)掘、合理保護(hù)和利用提供了重要信息。

同德縣地處青海省海南、黃南和果洛3個(gè)藏族自治州的交接處，是一個(gè)以牧為主，農(nóng)牧結(jié)合的少數(shù)民族地區(qū)，縣內(nèi)平均海拔3 660 m。畜牧業(yè)是該縣的主要產(chǎn)業(yè)之一，牦牛是其優(yōu)勢(shì)畜種和寶貴的動(dòng)物遺傳資源，存欄量達(dá)15.6萬(wàn)頭[8]。在先前同德牦牛的母系遺傳研究中，李廣禎等[9]對(duì)60頭同德牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行了測(cè)定分析，表明同德牦牛與其他牦牛品種(群體)相比，具有較豐富的母系遺傳多樣性且擁有2個(gè)母系支系。然而，當(dāng)前尚未見(jiàn)對(duì)同德牦牛父系遺傳分析的研究報(bào)道。鑒于此，本研究對(duì)同德牦牛的父系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)及父系起源進(jìn)行探究，以明確其父系遺傳多樣性水平、群體結(jié)構(gòu)組成及父系遺傳背景，為后續(xù)開(kāi)展同德牦牛遺傳資源的合理保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與基因組DNA提取

采用頸靜脈采血法在青海省同德縣秀麻鄉(xiāng)和河北鄉(xiāng)共采集32頭公牦牛的頸靜脈血樣，使用血液基因組DNA提取試劑盒(艾德萊生物科技有限公司，北京)提取基因組DNA，-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｑ獦硬杉?，仔?xì)詢(xún)問(wèn)牧戶(hù)并查詢(xún)相應(yīng)的牦牛系譜記錄，采用分戶(hù)隨機(jī)采樣方式開(kāi)展采樣，確保個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系。

1.2 引物合成、PCR擴(kuò)增與測(cè)序分型

參照馬志杰[5]報(bào)道的牦牛Y-SNPs標(biāo)記(即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3 和OFD1Y10)和Y-STR標(biāo)記(INRA189)序列合成6對(duì)引物(表1)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：2×Prime STAR Max Premix (上海寶生物公司) 10.5 μL，上、下游引物(10 pmol/L)各0.5 μL，基因組DNA 1.0 μL，超純水12.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性10 s，Ta ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；后冷卻至4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠(含Gold View 核酸染料)電泳、凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)后，將目的條帶單一、擴(kuò)增效率高的PCR產(chǎn)物回收純化，送至北京擎科生物有限公司進(jìn)行正、反向測(cè)序。同時(shí)，Y-STR INRA189標(biāo)記PCR產(chǎn)物測(cè)序分型由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 牦牛Y染色體分子標(biāo)記引物信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

將測(cè)序數(shù)據(jù)使用Chromas 2.3軟件進(jìn)行人工核對(duì)，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。用BioEdit7.2.5軟件[10]對(duì)32頭同德牦牛5個(gè)Y-SNPs標(biāo)記(SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3 和OFD1Y10)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多序列比對(duì)分析，檢測(cè)每個(gè)標(biāo)記中的SNP位點(diǎn)。同時(shí)，用GeneMarker 1.91 軟件[11]對(duì)每頭牦牛的Y-STRINRA189標(biāo)記測(cè)序分型結(jié)果進(jìn)行分析，確定其等位基因大小。通過(guò)2種標(biāo)記聯(lián)合分型確定每頭公牦牛的Y染色體單倍型及單倍型組。后采用DnaSP5.10.01[12]和Arlequin3.11軟件[13]確定同德牦牛的Y染色體單倍型數(shù)目，計(jì)算其Y染色體單倍型多樣度(Hd)大小。用Network10.1軟件[14]基于不同單倍型間的核苷酸變異繪制網(wǎng)絡(luò)中介圖(Median-Joining, MJ)以揭示單倍型(組)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 同德牦牛Y染色體標(biāo)記的多態(tài)性檢測(cè)

對(duì)32頭同德牦牛5個(gè)SNPs 標(biāo)記即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3 和OFD1Y10進(jìn)行PCR純化產(chǎn)物雙向測(cè)序，獲得的片段長(zhǎng)度分別為969 bp、470 bp、290 bp、971 bp和763 bp。對(duì)各標(biāo)記測(cè)序結(jié)果進(jìn)行多序列比對(duì)分析，除檢測(cè)到先前Ma等[4-5]確定的10個(gè)Y-SNPs外，本研究在同德牦牛AMELY3標(biāo)記中首次檢測(cè)到一個(gè)新的Y-SNP位點(diǎn)(即g.719 C>T)(圖1)。在對(duì)同德牦牛Y-STRINRA189標(biāo)記分型分析中，本研究共檢測(cè)到155 bp、157 bp和159 bp 3個(gè)等位基因(圖2)。

圖1 同德牦牛AMELY3標(biāo)記新的Y-SNP(g.719 C>T)位點(diǎn)測(cè)序峰圖

圖2 同德牦牛Y-STR INRA189 標(biāo)記分型結(jié)果

2.2 同德牦牛Y染色體單倍型確定及多樣度大小

參照先前研究報(bào)道中其他牦牛品種(群體)Y染色體單倍型的確定方法[3-5]，本研究對(duì)同德牦牛群體進(jìn)行Y染色體單倍型確定和綜合分析，結(jié)果共確定了6種Y染色體單倍型，即Y1H1、Y1H2、Y1H3、Y1H4、Y1H5和Y2H6(表2)。其中Y1H1為優(yōu)勢(shì)單倍型，共有15個(gè)個(gè)體共享，占總數(shù)的47%；Y2H6有8個(gè)個(gè)體共享，占總數(shù)的25%；Y1H5有4個(gè)個(gè)體共享，占總數(shù)的13%；Y1H2有3個(gè)個(gè)體共享，占總數(shù)的9%；而Y1H3和Y1H4單倍型均只包含1個(gè)個(gè)體，頻率最低，各占總數(shù)的3%，為稀有單倍型。計(jì)算結(jié)果表明，同德牦牛Y染色體單倍型多樣度(Hd)大小為0.714±0.060。

表2 同德牦牛Y染色體單倍型(組)信息

2.3 同德牦牛Y染色體單倍型系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)同德牦牛6種Y染色體單倍型構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖(圖3)，結(jié)果顯示：6種Y染色體單倍型分為2個(gè)大的單倍型組/支系(即Ⅰ和Ⅱ)。其中，Ⅰ單倍型組/支系包括5種單倍型(即Y1H1、Y1H2、Y1H3、Y1H4和Y1H5)，占總數(shù)的75%；而Ⅱ單倍型組/支系僅含有Y2H6一種單倍型，占總數(shù)的25%，提示同德牦牛由2個(gè)大的父系單倍型組/支系組成，以Ⅰ單倍型組/支系為主，有2個(gè)父系起源。

圖3 同德牦牛6種Y染色體單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖注：圖中圓面積大小與各單倍型頻率大小成正比

3 討 論

Y-SNP和Y-STR 作為2種主要的Y染色體分子標(biāo)記，在開(kāi)展哺乳動(dòng)物父系遺傳多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、起源等研究中發(fā)揮著重要的作用[3-7,15-18]。在先前牦牛的父系遺傳研究中，Li等[3]發(fā)現(xiàn)SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY2和OFD1Y10標(biāo)記中6個(gè)Y-SNPs可用于牦牛父系遺傳分析，在高原、環(huán)湖和天祝白牦牛中共確定了3種單倍型，提示各品種具有豐富的Y染色體遺傳多樣性。Ma等[4]對(duì)青海9個(gè)牦牛品種(群體)(即曲瑪萊、祁連、天峻、唐古拉山、郭勒木德、崗龍、雪多、大通和環(huán)湖牦牛)的父系遺傳分析中，表明郭勒木德群體具有最豐富的父系遺傳多樣性(Hd=0.706±0.038)。而在中國(guó)15個(gè)家牦牛和1個(gè)野牦牛品種/群體的父系遺傳分析中，馬志杰[5]在Li等[3]研究的基礎(chǔ)上在OFD1Y10標(biāo)記中發(fā)現(xiàn)4個(gè)新的Y-SNPs，共確定了14 種Y染色體單倍型，表明家、野牦牛擁有豐富的父系遺傳多樣性，但野牦牛的父系遺傳多樣性(Hd=0.821 4±0.100 7)高于家牦牛(Hd=0.696 4±0.014 1)；家牦牛品種(群體)中巴州牦牛的父系遺傳多樣性最高(Hd=0.727 3±0.066 7)，帕里牦牛的父系遺傳多樣性最低(Hd=0.117 4±0.073 2)。在本研究中，基于相同的5個(gè)牦牛Y-SNPs標(biāo)記(即SRY4、USP9Y、UTY19、AMELY3和OFD1Y10)和1個(gè)Y-STR標(biāo)記(即INRA189)，在對(duì)同德牦牛的父系遺傳分析中首次在AMELY3標(biāo)記中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的Y-SNP(g.719 C>T)，這不僅說(shuō)明同德牦牛群體含有不同于其他牦牛品種(群體)特殊的父系遺傳信息，而且進(jìn)一步表明牦牛Y染色體遺傳變異比較豐富且蘊(yùn)含著豐富的遺傳信息。在本研究中，在同德牦牛中共確定了6種Y染色體單倍型(即Y1H1、Y1H2、Y1H3、Y1H4、Y1H5和Y2H6)，與先前Li等[3]和馬志杰[5]的研究報(bào)道相比，其單倍型數(shù)目與大通、麥洼、巴州牦牛所擁有的單倍型數(shù)目(6種)相同，只低于高原牦牛的單倍型數(shù)目(7種)，而高于其他品種(群體)所擁有的Y染色體單倍型數(shù)(2～5種)。與此同時(shí)，本研究表明同德牦牛的Y染色體單倍型多樣度(Hd)為0.714±0.060，這與我國(guó)其他家、野牦牛品種(群體)Y染色體單倍型多樣度值(0.117～0.821)相比[5]，該值也較高，僅低于野牦牛(0.821±0.101)和巴州牦牛(0.727±0.067)的相應(yīng)值[5]，說(shuō)明同德牦牛具有豐富的父系遺傳多樣性。同德牦牛所處地理位置特殊，母系遺傳多樣性較高(Hd= 0.935±0.023)[9]，而本研究進(jìn)一步揭示其具有豐富的父系遺傳多樣性且擁有特殊的父系遺傳信息，說(shuō)明該群體蘊(yùn)含豐富的遺傳變異，可為牦牛品種(品系)培育提供良好的素材，故建議繼續(xù)深入開(kāi)展同德牦?；蚪M、轉(zhuǎn)錄組及蛋白組學(xué)等方面的系統(tǒng)研究，為其種質(zhì)資源的合理保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

動(dòng)物的起源和系統(tǒng)發(fā)育研究有助于揭示其進(jìn)化歷史、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和復(fù)雜的遺傳背景。先前對(duì)牦牛父系起源的研究中，表明我國(guó)家、野牦牛均擁有2個(gè)明顯的父系支系，提示牦牛有2個(gè)父系起源[3-6]。在本研究中，對(duì)同德牦牛6種Y染色體單倍型構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中，6種Y染色體單倍型也分為明顯的2個(gè)大分支，表明同德牦牛也由2個(gè)大的父系支系組成，有2個(gè)父系起源，這與前人對(duì)其他牦牛品種(群體)的研究結(jié)果一致[3-6]。

4 結(jié) 論

青海省同德牦牛群體具有豐富的父系遺傳多樣性，蘊(yùn)含特殊的父系遺傳信息，由2個(gè)父系支系組成，擁有2個(gè)父系起源。